[发明专利]一种大肠杆菌K88的快速检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种大肠杆菌K88的快速检测方法，尤其是涉及一种利用大肠杆菌K88菌毛蛋白适配体对大肠杆菌K88进行快速检测的方法。

背景技术

环境、食品携带病原菌致病是当今世界上最为普遍的问题之一。

在环境卫生不良的情况下，大肠杆菌（enterotoxigenic Escherichia coli)常随粪便散布在周围环境中，若在水和食品中检出大肠杆菌，可认为是被粪便污染的指标，从而证明可能有肠道病原菌存在。因此，大肠菌群数或大肠菌值常作为饮水和食物或药物的卫生学标准。

大肠杆菌为人和动物肠道中的常居菌，一般多数不致病，但在一定条件下可引起肠道外感染。大肠杆菌菌毛株含有特定的菌毛蛋白，与细菌对宿主上皮细胞的吸附起到至关重要的作用。它们大多数能产生耐热肠毒素与不耐热肠毒素黏附于小肠粘膜上皮并定居繁殖产生肠毒素导致严重腹泻、脱水最后衰竭死亡。

应用传统的检测方法检测大肠杆菌整个过程需要48-72h。利用快速检测技术与富集培养基技术相结合，能使整个过程所需时间减少：如利用大多数大肠杆菌血清型的运动性能发展的选择运动性富集技术，预富集和选择富集的结合技术；阻抗微生物学技术；利用过滤、离心和超声波从食品和竞争菌中移去目标菌并浓缩到一个小体积中的分离浓缩技术。免疫学技术构成了最大一类选择性技术，它们包括荧光抗体技术，ELISA技术。为了增加目标抗原量达到检测水平10⁵-10⁷cfu/ml, 大多数市场可获得的ELISA方法均结合了传统的预先和后选择富集培养基方法，整个检测过程还是需要24-56h。而核酸检测方法涉及DNA杂交和PCR技术，也包括菌落杂交，水溶液中单相杂交和几种商业PCR检测试剂盒,它们的检测下限为10⁰-10²cfu/ml。

从整体水平看，传统的检测技术要求低，不需要特殊的仪器，并且价廉。但最大的缺点是耗时费力。选择性技术明显克服了传统方法的缺点, 但富集过程复杂并且要求熟练工人操作，而且由于要得到一个阳性结果需要较高数量的目标菌，也不能在一天内得到结果。总之，现在还没有一种理想的技术用于检测环境中的大肠杆菌。

发明内容

本发明的目的在于克服现有大肠杆菌K88检测技术存在的缺陷,提供一种灵敏度高，设备简单，操作简便的大肠杆菌K88的快速检测方法。

本发明之大肠杆菌K88快速检测方法的技术方案是：

研究表明，适配体（Aptamers）是能够与许多目标分子（包括蛋白、药物、无机或有机分子等）发生高亲合性和特异性结合的一类单链核苷酸（DNA or RNA），长度通常在30-70核苷酸之间，能借助自身的折叠能力形成一个复杂的具有结合能力的口袋和沟糟三维结构，将小分子结合到它们的核酸结构中或者整合到大分子结构中，具有pmol的解离常数。至今发现高亲和特异性适配体的方法是配体指数富集系统展开（SELEX）。与抗体比较，适配体优势在于其大小和非蛋白质特性，并且在许多方面呈现较强的化学特性和生物学特性。最大的优势是不需要使用动物生产并可用体外方法分离制备。也可用化学合成生产、修饰，以提高它们的稳定性、亲合性、特异性、抗变性能力和寿命。

本发明技术方案的原理是：大肠杆菌K88菌毛蛋白的适配体能特异性的识别大肠杆菌K88，标记有荧光基团（FAM）的适配体与大肠杆菌K88结合后，适配体上的荧光信号通过荧光分光光度计捕捉，根据荧光信号的有无可以进行大肠杆菌K88的定性检测，根据不同的荧光强度，可以实现对大肠杆菌K88的定量检测。

应用大肠杆菌K88菌毛蛋白适配体检测大肠杆菌K88的具体方法，包括以下步骤：

（1）选择生化方法合成并完成荧光修饰的大肠杆菌K88菌毛蛋白适配体：5’端荧光基团修饰的大肠杆菌K88菌毛蛋白适配体，其基因序列是：

将上述大肠杆菌K88菌毛蛋白适配体用灭菌的超纯水溶解，使浓度为5μM，-20℃保存；使用之前，90-95℃处理5-10 min，置于冰上冷却至室温，使之变性；