[发明专利]一种大肠杆菌K88的快速检测方法

权利要求书

1.一种大肠杆菌K88的快速检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）选择生化方法合成并完成荧光修饰的大肠杆菌K88菌毛蛋白适配体：5’端荧光基团修饰的大肠杆菌K88菌毛蛋白适配体，其基因序列是：

将所述大肠杆菌K88菌毛蛋白适配体用灭菌的超纯水溶解，使浓度为5μM，-20℃保存；使用之前，90-95℃处理5-10 min，置于冰上冷却至室温，使之变性；

（2）制备已知浓度的检测体系：将1-3 ml大肠杆菌K88 接种于200-500ml LB培养基中，35-37℃ 180-200rpm培养26-32h后，进行平板计数，求出每毫升大肠杆菌的数目；用灭菌的超纯水按比例稀释成10²、10³、10⁴ 、10⁵ 、10⁶ 、10⁷ 、10⁸ 、10⁹cfu/ml 8个不同浓度溶液；各浓度溶液分别取500μl放于8个EP管中，6000-8000g离心10-20分钟后弃上清，每个EP管中加100-200μl 磷酸缓冲液悬浮菌体；

（3）将所述大肠杆菌K88菌毛蛋白适配体与待测细菌结合：50μl所述大肠杆菌K88菌毛蛋白适配体分别加入步骤（2）所述8个不同浓度的大肠杆菌K88溶液中吸打混匀，再加入磷酸缓冲液使终体积为500μl，37℃孵育1-2h后6000-8000g离心10-20min，弃上清；再分别加入500-1000μl PBS 吸打混匀， 8000g离心 10min 弃上清；重复3次，结合了大肠杆菌K88菌毛蛋白适配体的菌体沉淀悬浮于500μl 磷酸缓冲液中待用；

（4）用大肠杆菌K88菌毛蛋白适配体检测大肠杆菌K88, 测定荧光值，绘制标准曲线：分别将所述8个EP管中的溶液置于石英比色皿中，用荧光分光光度计测定450nm激发波长时520nm发射波长的荧光值；根据大肠杆菌K88浓度的对数值相应的荧光值绘制标准曲线；

（5）制备待测样品检测体系，测定待测样品的荧光值：取500-1000μl样品6000-8000g离心10-20 min，弃上清；沉淀悬浮于100-200μl PBS中，加入50μl大肠杆菌K88菌毛蛋白适配体至终体积500μl；再加入磷酸缓冲液使终体积为500μl，37℃孵育1-2h后6000-8000g，离心10-20min，弃上清；再加入500-1000μl 磷酸缓冲液吸打混匀，6000-8000g离心10-20min 弃上清；重复3次，结合了大肠杆菌K88菌毛蛋白适配体的菌体沉淀悬浮于500μl 磷酸缓冲液中待用；将溶液置于石英比色皿中，用荧光分光光度计测荧光值；

（6）根据测得的待测样品的荧光值，查大肠杆菌K88浓度的对数值与对应的荧光值标准曲线，即求得样品中大肠杆菌K88的含量。