[发明专利]可溶性表达Not I的工程菌及其构建方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种工程菌，尤其涉及一种高效可溶性表达Not I的工程菌及其构建方法，本发明还涉及该工程菌在制备Not I酶的应用，属于表达限制性内切酶Not I的工程菌构建领域。 

背景技术

限制性内切酶是当代基因工程研究不可缺少的重要工具，它的纯度直接影响基因克隆，核苷酸序列分析以及酶学性质研究等实验结果。自60年代末期，人们提出第一个限制性内切酶之后，越来越多的限制性内切酶被发现、提纯及应用。Not I是一种罕见的限制性内切酶，它可识别八个碱基的核苷酸序列(5′-GC/GGCCGC-3′)，在低盐的情况下它还可识别(5′-AC/GGCCGT-3′)。由于其识别位点每65kb的随机碱基序列中才出现一次，故可被用于基因组大片段的产生以及DNA甲基化定位图谱的绘制。Not I的识别位点中富含G:C序列，故其在真核生物基因组的GpC岛上出现频率较高。GpC岛通常位于基因转录起始区域，并且是DNA甲基化的热点区域，因此它可在很大程度上影响基因的表达。Not I对甲基化相当敏感，甲基化其识别位点的2或6位胞嘧啶上C5的任何一位都会阻止DNA被切割。基于其低频率性和甲基化敏感性，Not I通常可被用于在地标基因组扫描技术(Restriction Landmark Genomic Scanning，RLGS)中引进放射性标记物，这一技术已在肿瘤细胞中异常甲基化的研究中得到了广泛应用。 

Not I发现于1985年，作为一种罕见的限制性内切酶，其识别序列在E.coli K12中仅出现了23次。尽管Not I位点存在频率低，但即使是在可严格控制的表达系统中，其识别位点也必须进行修饰以使宿主菌得以生存，正是基于这一原因的存在，Richard D.等在其关于Not I的研究中提到，Not I限制性内切酶的成功克隆存在相当大的困难。J.A.McClarin等人，在1986年发表的应用X-射线晶体学技术测定限制性内切酶-DNA复合物分子结构的研究中指出，II型限制性内切酶是以同型二聚体的形式与靶DNA序列发生作用的。 

在常规分子生物学实验中Not I是一种十分常用的限制性核酸内切酶，但在商业化生产中仍存在重组菌株蛋白产量低、纯化工艺复杂等原因。之前报道的Not I纯化流程涉及到了磷酸纤维素阴离子交换柱、肝素琼脂糖亲和层析柱、DEAE-琼脂糖柱、PEI柱四步上柱洗脱过程，最后再将Not I在其存储缓冲液中透析过夜，整个纯化流程约需3-4d，工艺繁琐且蛋白损失严重。 

发明内容

本发明的目的之一是提供一株高效可溶性表达Not I的工程菌； 

本发明的目的之二是提供一种构建上述高效可溶性表达Not I的工程菌的方法； 

本发明的目的之三是将上述工程菌应用于表达Not I的表达和纯化，并对所述表达和纯化方法进行优化； 

本发明上述目的是通过以下技术方案来实现的： 

一株高效可溶性表达Not I的工程菌，包括：甲基化酶Eag I M基因、限制性内切酶Not I基因和大肠杆菌(E.coli)ER2566(mcrC- mrr)。 

其中，所述甲基化酶Eag I M基因的碱基为SEQ ID NO.1所示，所编码的氨基酸为SEQ ID NO.2所示；所述限制性内切酶Not I基因的碱基为SEQ ID NO.3所示，所编码的氨基酸为SEQ ID NO.4所示； 

其中，所述大肠杆菌(E.coli)ER2566(mcrC-mrr)是大肠杆菌E.coli的突变株，其缺失了甲基化抵制系统。 

本发明还提供一种构建高效可溶性表达Not I工程菌的方法，包括：(1)将甲基化酶Eag I M基因与原核表达载体可操作性的相连接，得到重组质粒；将重组质粒转化大肠杆菌(E.coli)ER2566(mcrC-mrr)，构建得到中间菌；(2)将限制性内切酶Not I基因与原核表达载体可操作性的相连接，得到重组质粒；(3)将步骤(2)所得到的重组质粒转化步骤(1)所得到的中间菌，筛选，鉴定，即得。 

其中，步骤(1)中所述的原核表达载体优选为pBR322；步骤(2)中所述的原核表达载体优选为pACYC184； 

大肠杆菌(E.coli)ER2566(mcrC-mrr)、pBR322和pACYC184都可通过商业途径购买得到。 

本发明的另一个目的是提供一种制备Not I的方法，包括：培养所构建的工程菌，诱导蛋白表达；收集、纯化所表达的蛋白，即得。