[发明专利]鸭病毒性肝炎毒株及灭活疫苗

权利要求书

1.一种鸭病毒性肝炎毒株，命名为DHV YC，该毒株保藏号为CGMCC NO.3594。

2.一种制备权利要求1所述鸭病毒性肝炎毒株的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)病料处理：从发生鸭病毒性肝炎的鸭场，采集发生明显病变的鸭肝病料，用含青霉素和链霉素双抗的灭菌PBS冲洗后，再用灭菌PBS稀释研磨，将制得的匀浆液经两次冻融后，离心取上清液再用氯仿震荡，离心取上层清液，滤膜过滤得鸭肝炎病毒悬液，分装，冻存；

(2)鸭肝炎病毒鸡胚适应株的建立：将步骤(1)获得的鸭肝炎病毒悬液用灭菌PBS作稀释，经尿囊腔接种SPF鸡胚，孵育，弃去24h内的死胚，选接种后48～96h死亡且病变典型的鸡胚，分别收获鸡胚液，装于灭菌容器中，将检验无菌的鸡胚液混合，定量分装，将所述的鸡胚液连续传18～25代，获得鸭肝炎病毒鸡胚适应株。

3.如权利要求2所述制备鸭病毒性肝炎毒株的方法，其特征在于，步骤(1)为从发生鸭病毒性肝炎的鸭场，采集发生明显病变的鸭肝病料，用含100IU/ml青霉素、100mg/ml链霉素的双抗的灭菌PBS冲洗3次后，用病料5倍重量的灭菌PBS稀释研磨；将制得的匀浆液经-20℃冻结，20℃融化两次冻融后，以3000r/min和8000r/min的转速各离心15min，上清液用氯仿在室温下震荡10～15min，离心取上层清液，0.22μm滤膜过滤，分装，-70℃冻存。

4.如权利要求2所述制备鸭病毒性肝炎毒株的方法，其特征在于，步骤(2)为将分离的病毒用灭菌PBS作1∶100稀释，经尿囊腔接种20枚9日龄SPF鸡胚，每胚0.1ml，置37℃孵育，弃去24h内的死胚，选接种后48～96h死亡且病变典型的鸡胚，分别收获鸡胚液，装于灭菌容器中，将检验无菌的鸡胚液混合，定量分装，每瓶1ml，以1∶1的比例加入含5％质量百分比蔗糖、12％质量百分比脱脂奶的冻干保护剂，冻干后，置-20℃保存。

5.一种利用权利要求1所述的鸭病毒性肝炎毒株制备的鸭病毒性肝炎灭活疫苗的方法，其特征在于，由以下步骤制备的：

(1)接种：将权利要求1所述鸭病毒性肝炎毒株，用灭菌PBS稀释后接种于SPF鸡胚，收集48～96h内死亡且病变明显的鸡胚液；

(2)灭活：将检验合格的鸡胚液加入灭活剂，灭活后在37℃水浴条件下水解，作为制苗用抗原液；

(3)乳化制备疫苗：油相制备：取白油、司本-80，混匀后加入硬脂酸铝；水相制备：取抗原液、吐温-80，加入免疫增强剂，再加入灭菌生理盐水，混匀备用。取油相置于乳化缸中，预乳化同时缓慢加入水相乳化，终止前加入硫柳汞水溶液，得到鸭病毒性肝炎灭活疫苗；

(4)分装：定量分装，加盖密封，2～8℃保存。

6.如权利要求5所述的制备鸭病毒性肝炎灭活疫苗的方法，其特征在于，所述步骤(2)中加入的灭活剂为终浓度0.1％～0.3％体积百分比的甲醛溶液或0.025％～0.05％质量百分比的β-丙内酯。

7.如权利要求5所述的制备鸭病毒性肝炎灭活疫苗的方法，其特征在于，所述步骤(3)乳化的水相制备中加入的免疫增强剂为异丙肌苷。

8.如权利要求5所述的制备鸭病毒性肝炎灭活疫苗的方法，其特征在于，所述步骤(3)成品含异丙肌苷的质量百分比为0.56％～2.22％。

9.一种按照权利要求5-8任意一种方法制备的鸭病毒性肝炎灭活疫苗。