[发明专利]一种在蛋白质水平精确定量检测抗朊病毒药物作用效果的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种在酵母细胞中检测抗朊病毒药物作用效果的方法，特别涉及一种在蛋白质水平的精确定量检测抗朊病毒药物作用效果的方法。

背景技术

朊病毒是一类能在动物和人中引起可传染性脑病(包括疯牛病、羊搔痒症、库鲁病、克雅氏病等)的病原体，其高度传染性和致死性对整个社会造成了极大的危害。关于朊病毒的分子致病机理和治疗药物筛选、开发的研究是国际上生物学、医学领域研究的前沿和热点。目前国际上一般使用SDS-PAGE/Western Blot来在蛋白质水平通过检测细胞内朊病毒蛋白聚集体的可溶性的变化来评估抗朊病毒药物的作用效果，这种方法首先通过高速离心将细胞内可溶状态的单体朊蛋白与不可溶状态的聚集体朊蛋白分开，然后分别进行SDS-PAGE/Western Blot，从而通过条带的有无以及条带亮度来判断细胞内的朊病毒的聚集状态。尽管这是一种行之有效的方式，但是使用这种方法不能够定量测定朊病毒蛋白聚集体的分子量大小的变化。而朊病毒蛋白聚集体的分子量大小是其致病性、传染性的根本原因，其聚集体的分子量大小的变化是抗朊病毒药物作用效果的重要指标。因此，尤其是在基于酵母细胞的抗朊病毒药物筛选中，需要一种更为有效的方法来对药物的作用效果进行精确地检测与评估。

发明内容

针对国际上不能够定量测定朊病毒蛋白聚集体的分子量大小的变化的不足，本发明提供一种新型的采用半变性琼脂糖凝胶电泳结合蛋白质印迹的方法(SDD-AGE/Western blot)，用琼脂糖凝胶电泳来定量检测朊病毒蛋白聚集体的分子量大小的变化，以解决测定朊病毒蛋白聚集体的分子量大小方面的技术问题。

本发明使用的菌种为野生型酿酒酵母细胞(Saccharomyces cerevisiaeATCC 208719)，来自于美国标准菌种库(American Type Culture Collection，ATCC)，保藏编号为208719。这种野生型酿酒酵母细胞带有[PSI⁺]朊病毒，即Sup35p呈聚集状态，表现为较大的分子量，菌落颜色表现为白色；经药物作用后，聚集的Sup35p解聚，不同的药物促进Sup35p聚集体解聚的能力不同，从而表现出不同的分子量，菌落的颜色也随着聚集体的变化而变化——Sup35p聚集体越小菌落颜色越深，即随着Sup35p聚集体从大到小，菌落依次表现为白色，粉色，红色。彻底治愈的细胞内Sup35p完全解聚呈单体，表现为恒定的较小的分子量(约为74kDa)，菌落颜色表现为红色，称为[psi^-]细胞。

本发明采用的技术方案是：一种在蛋白质水平精确定量检测抗朊病毒药物作用效果的方法，其步骤如下：

1)酿酒酵母细胞的活化：

取酿酒酵母细胞(Saccharomyces cerevisiae ATCC 208719)接入YPD液体培养基中，30℃水浴振荡培养18h，然后进行酵母菌初始OD值的调试，调制菌悬液OD₆₀₀＝0.5；

2)抗朊病毒药物的初筛选：

取无菌冻存管，加入待测药物、YPD液体培养基以及调试好的酿酒酵母细胞菌悬液，在24℃的条件下，振荡培养，每天定时取前一天冻存管中的酿酒酵母细胞放入新的装有YPD液体培养基和待测药物的无菌冻存管中，振荡培养1～5天，每天取菌悬液少量稀释涂平板到1/2YPD固体培养基上，通过观察菌落颜色的变化初步判断待测药物的治疗效果；

Sup35p呈聚集状态时，朊病毒蛋白聚集体表现为较大的分子量，菌落颜色表现为白色；经药物作用后，聚集的Sup35p解聚，菌落的颜色也随着聚集体的变化而变化——Sup35p聚集体越小菌落颜色越深，即随着Sup35p聚集体从大到小，菌落依次表现为白色，粉色，红色。彻底治愈的细胞内Sup35p完全解聚呈单体，表现为恒定的较小的分子量(约为74kDa)，菌落颜色表现为红色。

3)定量检测抗朊病毒药物的作用效果：

酿酒酵母细胞裂解液的制备：取经药物治疗不同时间后稀释涂平板在1/2YPD上长出的单菌落，按菌落颜色分组，每组挑取3-5个单菌落接种到10ml YPD液体培养基中活化18h，然后再以1％的接种量接种到50mlYPD液体培养基中扩大培养12h，离心收集细胞，然后加入裂解缓冲液，用珠磨仪裂解细胞，离心收集上清得到蛋白样品；