[发明专利]一种鼠疫耶尔森菌的蛋白质悬浮芯片制备及定量检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)蛋白质悬浮芯片的制备方法及其定量检测方法。

背景技术

鼠疫耶尔森菌(Y.pestis，简称鼠疫菌)是鼠疫的病原菌，为革兰氏阴性球杆菌、不运动、不形成芽孢，吉母萨、瑞特氏或威森染色呈双极浓染，能在4-40℃范围内生长，最适生长温度为28-30℃，最适生长pH值为7.2-7.6，pH的耐受上下极限分别为pH5.0和pH9.6。鼠疫菌主要宿主为啮齿动物，主要通过蚤的叮咬在动物间传播，也可传播到人，引起病人发烧、寒颤、头痛，有少数患者会由败血型鼠疫发展为肺鼠疫。

鼠疫在历史上曾经引起三次世界范围的大流行，使人类遭受了深重的灾难。2000年世界卫生组织(WHO)将鼠疫列为重新抬头的传染病。同时，鼠疫菌传染性强、发病迅速，是生物战剂和生物恐怖的重要病原之一。出于公共卫生和国家安全的目的，研究和开发快速、定性、定量检测传染病病原体是所属技术领域中长期致力追求的目标。尤其对于鼠疫菌来说，作为一种烈性传染病的病原体，能否实现定量检测至关重要。目前用于鼠疫菌的实验室常规检测方法有细菌学检测方法、血清学检测方法及检测核酸的分子生物学方法。但是，细菌学检测方法、血清学检测方法(例如间接血凝方法)及核酸检测法等现有检测技术存在许多缺陷。对于细菌学检测法，细菌培养耗时较长，不适合对鼠疫菌的快速检测。荚膜抗原(F1抗原)是目前公认的鼠疫菌种特异性抗原之一，检测鼠疫菌F1抗原及其抗体是鼠疫诊断的重要依据。检测鼠疫菌特异性抗体(F1抗体)的间接血凝方法(IHA)，灵敏度低，特异性差。对于核酸检测法，尽管采用了PCR技术对鼠疫菌进行检测和分析，尤其是实时荧光定量PCR技术，特异性高，不容易被污染，但是现有PCR技术的方法繁琐，特别是此类方法包括DNA/RNA的提取和复杂的操作步骤，而且不能用于非核酸物质如蛋白质的检测，因此核酸检测法具有局限性且不方便。

悬浮芯片(suspension array)也称液相芯片(liquid array，liquidchip)，是20世纪70年代美国Luminex公司研制出的新一代生物芯片技术，利用带编码的微球体作为载体，流式细胞仪作为检测平台，对核酸、蛋白质等生物分子进行大规模测定。目前，该技术已广泛应用于免疫分析、核酸研究、酶学分析、抗体筛选及受体与配体的识别分析等领域。悬浮芯片的基本原理是利用聚苯乙烯(polystyrene)所制作的微球，包覆不同比例的红光及红外光发色剂，而产生100种不同比例颜色，作为100种独特的色彩编号，每颗微球大小约5.5μm，可依不同研究目的如免疫分析、核酸研究、酶分析、受体和配体识别分析等，并根据不同研究目的而标定特定抗体、核酸探针及各种受体探针。标记探针的微球与待测物在96孔板中进行反应。反应后，利用机器自动将反应液吸起并通过一微细管检测通道，每次仅允许一个微球通过检测通道。检测通道中设有两道激光，一道为红色，激发微球基质中的颜色，识别微球分类编码以确定检测项目；一道为绿色，激发报告分子的颜色，记录信号强弱以检测待测物的含量。当待测样本与特定微球的探针吸附在一起时，两道激光所激发的光都可被检测到。而若样本中不含该标的物，则仅有微球中的激发光可被检测到。再通过机器与计算机自动统计分析两道激光所激发的微球种类与数量，从而判定待测样本中有几种测试目标物在其中，得知测试样本中有无待测病原存在，或同时存在有几种至数十种病原。悬浮芯片技术由于利用微球在溶液中反应，克服了片膜芯片在大分子检测时受表面张力、空间效应等对反应动力学的影响，同时利用激光检测技术，大大提高了样品检测的准确性和重复性，具有优于片膜芯片的操作简便、重复性好等特点。

目前发展的悬浮芯片主要是基于实验室检测方法的建立和方法评价及优化，以缩短检测时间，降低方法的检测成本。但是悬浮芯片是否能够检测鼠疫菌，是否适合从粉末、液体等样品中快速直接检测，其定量检测能力如何，尚缺乏模型和评价。

发明内容

本发明涉及一种鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)的蛋白质悬浮芯片的制备及定量检测方法。

本发明提供一种检测鼠疫菌的蛋白质悬浮芯片，其特征在于，所述悬浮芯片包括：编码微球(如028号)包被鼠疫菌的捕获抗体(如兔抗F1 Ag抗体)、生物素标记的鼠疫菌检测抗体(如兔抗F1Ag单抗2F6)、链亲和素-藻红蛋白(SA-PE)及相关缓冲溶液。