[发明专利]多西环素残留的ELISA检测方法及试剂盒与应用

说明书

技术领域

本发明属于免疫化学分析技术领域。具体涉及多西环素残留酶联免疫(ELISA)检测方法及试剂盒与应用，适用于可食性动物组织中(肌肉、肝脏等)多西环素药物的残留快速检测。 

背景技术

多西环素是一种广谱抗生素，对许多种革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都有抑制或杀灭作用，如：链球菌、炭疽杆菌、某些葡萄球菌、破伤风杆菌、巴氏杆菌、沙门氏菌、布氏杆菌、克雷伯氏菌和嗜血杆菌等。除此之外多西环素还对一些衣原体、支原体、立克次氏体、螺旋体等有一定的抑制作用。但多西环素也有很多的副作用，如：诱发低血糖、引起颅内高压、致光敏反应、致肝损伤。多西环素在动物组织中残留会威胁食品安全，对人体健康造成危害。为此，欧盟在2003年7月对多西环素在猪体内的最高残留量作了规定，肌肉、脂肪、肝脏和肾脏的最高残留量分别为100ug/kg、300ug/kg、300ug/kg和600ug/kg；中华人民共和国农业部235号公告《动物食品中兽药最高残留限量》，对多西环素在动物组织中残留也制定了最高残留限量。 

目前在动物性食品中多西环素的分析检测方法有很多，包括高效液相色谱法、薄层色谱法、液相色谱-质谱联用法、微生物法、酶联免疫法。但微生物方法存在检测时间长、缺乏特异性，容易导致假阳性和假阴性产生。仪器检测主要存在仪器购置费用昂贵、样品前处理复杂、程序繁琐费时、检测费用高、不能现场操作等缺陷，所以在生产中应用受到限制。近年来，ELISA法以其灵敏、快速、特异、简便等优点，在兽药、农药残留检测领域已被广泛应用。目前还没有针对多西环素ELISA检测方法及试剂盒报道。 

本发明应用免疫学技术筛选出抗多西环素(DOX)的多克隆抗体(DOX pAb)，研制针对多西环素药物残留快速检测试剂盒，并对其性能进行测定。试剂盒检测范围较宽，假阳性低，检测灵敏、准确、可靠，适用于动物可食性组织如肌肉、肝脏中多西环素检测。 

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，制备一种抗多西环素多克隆抗体。利用该多克隆抗体，建立一种特异性强、灵敏度高、且操作简单，对样品简单处理即可检测多西环素残留的ELISA检测方法。同时组装一种多西环素药物残留的ELISA试剂盒，作为对可食性动物组织中多西环素药物残留的ELISA检测试剂盒中的应用。 

本发明的技术方案是： 

一种多西环素药物残留的ELISA检测方法，包括制备免疫原、包被原、抗体、酶标板和样品前处理，其步骤如下： 

(1)将半抗原多西环素用对氨基苯甲酸作连接臂，再与牛血清白蛋白(BSA)或鸡卵清白蛋白(OVA)偶联合成免疫原(DOX-PABA-BSA)； 

(2)将半抗原多西环素采用赫夫曼消除反应后，再与牛血清白蛋白或鸡卵清白蛋白偶联合成包被原 (DOX-OVA)； 

(3)将步骤(1)合成的多西环素免疫原免疫兔，得到特异性兔多克隆抗体； 

(4)将步骤(2)合成的多西环素包被原包被固相载体(酶标板)； 

(5)将待检可食性动物组织进行处理，用样品稀释液得到检测样品； 

(6)对步骤(5)的待测样品进行ELISA测定。 

其中(5)所述样品稀释液0.01M pH7.4 PBS的组分及配比为：8.0g NaCl，0.2g KCl，2.9gNa₂HPO4·12H₂O，0.2g KH₂PO4，加蒸馏水至1000mL。 

一种多西环素药物残留的ELISA检测试剂盒，其包括：盒体(1)，设在盒体内的酶标板(2)，多西环素标准品(3)，抗多西环素抗体(4)，洗涤液(5)，样品稀释液(6)，辣根过氧化酶标记羊抗兔抗体(7)，底物液(8)，底物A储存液(9)，底物B储存液(10)和终止液(11)； 

其中： 

所述的试剂组分及其配比如下： 

包被液为0.05mol/L pH9.6的碳酸盐缓冲液：1.59g Na₂CO₃，2.93g NaHCO₃，加蒸馏水定容至1000mL；