[发明专利]多西环素残留的ELISA检测方法及试剂盒与应用

权利要求书

1.一种多西环素药物残留的ELISA检测方法，包括制备免疫原、包被原、抗体、酶标板 和样品前处理，还包括制备试剂盒中的包被液，浓缩洗涤液，封闭液，底物缓冲液，底物A 储存液，底物B储存液，底物显色液，终止液和样品稀释液，其具体步骤如下：

(1)将半抗原多西环素用对氨基苯甲酸作连接臂，再与牛血清白蛋白偶联得到免疫原；

(2)将半抗原多西环素采用赫夫曼消除反应后，再与鸡卵清白蛋白偶联得到包被原；

(3)将步骤(1)合成的多西环素免疫原免疫得到特异性兔多克隆抗体；

(4)将步骤(2)合成的多西环素包被原包被所述的酶标板；

(5)制备包被液，浓缩洗涤液，样品稀释液，封闭液，底物缓冲液，底物A储存液，底物B 储存液，底物显色液和终止液；

(6)将待检可食性动物组织进行处理，用0.01M pH7.4磷酸盐缓冲液稀释处理得到待测样 品；

(7)对步骤(6)待测样品进行ELISA测定；

其中：

步骤步骤(1)所述的免疫原的制备方法如下：

称取对氨基苯甲酸27.4mg溶于4mL1mol/L的HCl中，在冰水浴中，边搅拌边逐滴加入 现配的1mol/L NaNO₂ 0.4mL，4℃避光反应10min，边反应边搅拌；取少量与苯胺反应，若 反应体系变成深黄色，表明重氮化反应成功，得溶液A，备用；称取多西环素0.088g，溶解 在3mL三蒸水中，制成多西环素溶液，将溶液A逐滴加入多西环素溶液中，调节pH8-9，磁 力搅拌反应2h，离心取上清液，加入三丁胺6.8μL到离心上清液中，混合后再加氯甲酸异丁 酯3.8μL，于4℃磁力搅拌反应25min，得溶液B；称取340mg牛血清白蛋白先溶于5mL磷酸 盐缓冲液(PBS)，在冰水浴且磁力搅拌下加入5mL的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液，得溶 液C；在磁力搅拌下将溶液B加入到溶液C中，置4℃冰箱反应过夜，离心去沉淀，取上清液 用0.01mol/L pH7.4磷酸盐缓冲液透析3天，冻干，于-20℃保存，备用；

步骤(3)所述的特异性兔多克隆抗体的制备方法如下：

用步骤(1)所述的免疫原免疫新西兰大白兔，基础免疫时是将步骤(1)所述的免疫原 用灭菌的PBS缓冲液溶解稀释，加等体积的弗氏完全佐剂充分乳化，采用颈背部多点皮下注 射；再用前述方法进行加强免疫，其佐剂为不完全佐剂；从第3次加强免疫开始，免疫后第 8d，耳静脉采血，测定抗体效价和特异性后，再采血，分离抗血清，经饱和硫酸铵分级沉淀 得到纯化后的抗多西环素多克隆抗体；

步骤(5)所述的包被液，浓缩洗涤液，样品稀释液，封闭液，底物缓冲液，底物A储 存液，底物B储存液，底物显色液和终止液的组分及其配比如下：

包被液：1.59g Na₂CO₃，2.93g NaHCO₃，加蒸馏水定容至1000mL；

浓缩洗涤液：8.0g NaCl，0.2g KCl，2.9g Na₂HPO₄·12H₂0，0.2g KH₂PO₄，0.5mL吐温 -20，加蒸馏水至100mL；

封闭液：鸡卵清白蛋白1g，将该鸡卵清白蛋白溶于100mL pH7.4磷酸缓冲液中；

底物缓冲液：4.91g柠檬酸·H₂O，19.38g Na₂HPO₄·12H₂O，加三蒸水至1000mL；

底物A储存液：100mg四甲基联苯胺，50mL无水乙醇；

底物B储存液：75mg过氧化氢脲，10mL三蒸水；

底物显色液：在体积为10mL的底物显色液中含有9.5mL底物缓冲液，32μL底物B 储存液，0.5mL底物A储存液；

终止液：2mol/L H₂SO₄溶液，和

样品稀释液：0.01M pH7.4磷酸盐缓冲液。