[发明专利]一种检测鱼类精子线粒体损伤的方法

说明书

技术领域

本发明属于水产养殖技术，涉及到一种检测鱼类精子线粒体损伤的方法

背景技术

在养殖生产中常常需要对鱼类进行催产繁育，而鱼类精子质量的好坏是繁育中非常重要的一个环节，直接影响受精率、孵化率和成活率等。鱼类精子排出体外后，其活力容易受到外界各种环境因子的影响，不同的环境条件(温度、光照等)都会对精子造成一定损伤，从而影响精子的质量，降低受精率、孵化率和成活率，给养殖生产带来极大损失。精子线粒体是维持精子正常生理功能的能量来源，线粒体上含有多种参与能量代谢的酶，给精子的运动提供所需的能量，因此线粒体功能的好坏直接反映了精子运动能力的强弱。目前检测鱼类精子线粒体损伤的方法是通过扫描电镜和透射电镜进行观察，但这种方法只能从外观进行定性观察，不能定量分析和统计，且仪器价格昂贵，操作较为烦琐。

发明内容

本发明需要解决的问题是提供一种检测鱼类精子线粒体损伤的方法。

本发明采集一定数量的鱼类新鲜精子和经过低温处理的精子，将2份精液标本分别用0.01mol/L、PH 7.4的PBS洗涤2次后300×g离心5min；PBS悬浮沉淀精子，调精子密度为1×10⁶/ml，加入Rhl23，37℃水浴孵育10min，离心弃上清，PBS重复洗涤离心2次，PBS悬浮，加入PI，终浓度10ug/ml，染色5min，利用FACSCalibur型流式细胞仪检测，仪器状态设置：前向散射FSC与侧向散射SSC为线性放大，荧光通道FL1和FL2对数放大，测每个精子的荧光强度，每份悬液检测10000个精子，数据用Cell Quest软件进行分析；右下象限Rhl23⁺/PI^-为线粒体膜功能良好的精子，左下象限Rhl23⁺/PI^-为线粒体膜功能丧失的精子，左上象限Rhl23^-/PI⁺为坏死精子。

本发明与现有技术相比，本发明通过采用荧光双染法对线粒体正常和受到损伤的精子进行染色，经过前处理后直接用流式细胞分析仪进行检测，可定量区分线粒体膜功能良好的精子、线粒体膜功能丧失的精子和坏死精子，结果更直观，更可靠。

具体实施方式

在鱼类的繁殖季节，采集一定数量的鱼类新鲜精子和经过低温处理的精子，将2份精液标本分别用PBS(0.01mol/L，PH 7.4)洗涤2次后300×g离心5min。PBS悬浮沉淀精子，调精子密度为1×10⁶/ml，加入Rhl23(终浓度10ug/ml)，37℃水浴孵育10min，离心弃上清，PBS重复洗涤离心2次，PBS悬浮，加入PI(终浓度10ug/ml)染色5min，利用FACSCalibur型流式细胞仪(美国BD公司)检测，仪器状态设置：前向散射FSC与侧向散射SSC为线性放大，荧光通道FL1(绿)和FL2(红)对数放大，测每个精子的荧光强度，每份悬液检测10000个精子，数据用Cell Quest软件进行分析。新鲜精液与处理精液结果比较采用非参数the Mann-Whitney U test进行分析，P＜0.05为差异显著。检测结果中右下象限Rhl23⁺/PI^-(绿色)为线粒体膜功能良好的精子，左下象限Rhl23⁺/PI^-(黑色)为线粒体膜功能丧失的精子，左上象限Rhl23^-/PI⁺(红色)为坏死精子。分别统计线粒体膜功能良好、线粒体膜功能丧失和坏死精子的比例。

运用此方法能准确检测鱼类精子的线粒体损伤，对损伤程度进行量化，结果更直观，更可靠，检测准确率达到99％以上。