[发明专利]动物华支睾吸虫病特异性检测引物、检测方法和检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及动物华支睾吸虫病的基因学鉴定，特别是涉及动物华支睾吸虫病特异性检测引物、检测方法和检测试剂盒。

背景技术

华支睾吸虫病是由后睾科支睾属的华支睾吸虫(Clonorchis sinensis)寄生于犬、猫、猪等动物及人胆管内所引起的一种重要的人兽共患寄生虫病，俗称肝吸虫病。

华支睾吸虫寄生在淡水螺、淡水鱼、淡水虾、犬、猪、牛、鼠、家兔、豚鼠、狐狸和家禽等动物，人为终末宿主，本病可使肝脏肿大并导致其他肝病变，病情多呈慢性经过，临床上可见精神沉郁，食欲减退和下痢等症状，重者可致肝硬化甚至癌变，少数儿童和青少年患者可致侏儒症，并发症多达21种，对人类健康的影响不容忽视。

华支睾吸虫病呈地方性流行，在东南亚国家较常见，该病在我国已有很长的历史，流行广泛，目前华支睾吸虫病有逐年上升的趋势，其发生和流行除了跟人们的一些不良饮食习惯如生食鱼虾等有关系外，其中间宿主(淡水螺、淡水虾等)以及保虫宿主(保虫宿主有猫、犬、猪、牛、鼠、狐狸和家禽等动物)在其流行过程中是十分重要和关键的环节。

分子生物学方法已开始应用于华支睾吸虫的分子鉴定上。PCR以其高度的特异性和敏感性，已广泛应用于分子生物学研究的各个领域，尤其对各种病原体的检测和疾病的诊断中。目前，在寄生虫学领域，用于疾病诊断和虫体检测的PCR方法很多，如常规PCR、反转录PCR、套式PCR、免疫磁性捕获PCR、荧光定量PCR(FQ-PCR)等。

Le(Le TH，Van De N，Blair D，et al.Clonorchis sinensis and Opisthorchisviverrini：development of a mitochondrial-based multiplex PCR for theiridentification and discrimination.Exp Parasitol.2006，112(2)：109-14)通过设计两对线粒体DNA引物，用多重PCR方法成功对华支睾吸虫和麝猫后睾吸虫进行鉴别诊断，能检测到最低样品DNA量为0.78ng；Parvathi等(Parvathi A，JieyuanL，Iddya K，et al.Clonorchis sinensis：Development and evaluation of a nestedpolymerase chain reaction(PCR)assay.Exp Parasitol，2007，115(3)：291-295)首先对华支睾吸虫的基因组用随机引物进行扩增测序，选择合适的部位设计两对引物进行巢式PCR，结果表明，该方法具有很好的敏感性和特异性，能检测到鱼肉中最低华支睾吸虫囊蚴的DNA为10^-5ng，有望在华支睾吸虫鱼的流行情况调查以及动物的粪便检查中得到应用。

人体华支睾吸虫病诊断技术的研究一直是医学研究中的一个热点，已建立了多种诊断检测方法，包括虫卵检查、皮内试验(IT)、B超、CT、间接血凝免疫吸附试验(ELISA)、单克隆抗体ELISA(McAb-ELISA)以及免疫胶体金方法等，但在兽医领域，均未见应用于动物华支睾吸虫病的诊断，目前动物华支睾吸虫病主要还是依靠粪检患畜虫卵的方法进行流行病学调查，因为此种方法敏感性不高，极易漏检，也易误诊。

从粪便中提取DNA一直是个难点，粪便的成分复杂，含有各种各样抑制PCR的物质，如胆盐、多糖等。目前能从粪便中提取DNA的方法要么就是需要繁琐的步骤，如免疫磁性分离法、梯度离心法、荧光激活细胞分选术等，要么就是需要用到昂贵的DNA提取试剂盒。如能用快速、简便的方法从粪便中提取到寄生虫的DNA，将会有重大的意义，能对疾病进行及早的诊断，预防疾病的发生。

PCR检测方法敏感性高、一次检测大量样品、避免主观偏差等优越性预示着它在特异性诊断、流行病学调查和药物治疗监控等方面有着广阔的应用前景。

内转录间隔区(Internal Transcribed Spacer，ITS)是核糖体DNA中介于18S和28S之间的内转录间隔区，包括第一、第二内转录间隔区(ITS-1和ITS-2)两段序列，ITS序列存在于高度重复的核糖体中，进化速度快且长度不大，加上协同进化使该片段在基因组不同单元间十分一致，因而十分适合进行各种分子操作。

发明内容