[发明专利]中华绒螯蟹Crustin-1基因及体外重组表达

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及中华绒螯蟹Crustin-1基因序列，具体地说是从中 华绒螯蟹cDNA文库中筛选出中华绒螯蟹Crustin-1相关的EST序列，并拼接成全序列，并 进行了原核重组表达，还涉及到该基因及其表达产物在药物生产、饲料添加剂以及防腐剂和 保鲜剂生产中的应用。

背景技术

抗菌肽是广泛存在于生物界中的双亲性小分子碱性多肽，是机体固有免疫的关键因子。 自Steiner发现天蚕素Cecropin以来，到目前为止，在各种生物中总共发现了800多种抗菌肽。 根据抗菌肽的序列、二级结构和抗菌特性等，将已发现的抗菌肽分为四大类：(1)不含半胱 氨酸的线型抗菌肽，如天蚕素、马盖宁等；(2)具有半胱氨酸的环型抗菌肽，如防御素等； (3)富含某一种或两种氨基酸的抗菌肽，主要包括富含脯氨酸的抗菌肽以及富含甘氨酸的抗 菌肽等；(4)由前体大分子酶解产生的抗菌肽，如鲎的血蓝蛋白。Crustin作为一种针对革兰 氏阳性菌的抗菌肽，首先是在岸蟹中发现的(Relfet al.，1999)。随后的研究发现其氨基酸序 列在在其C-末端有12个Cys，其中8个位置保守，可形成WAP结构域。

中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)又名河蟹，因其营养丰富、味道鲜美而深受人们喜爱，是 我国重要的水产养殖品种之一。自20世纪80年代以来，中华绒螯蟹养殖业发展迅速，到2000 年全国养殖产量已超过100000t，年产值达120-150亿元，已成为水产养殖支柱产业之一(崔 朝霞等，2003)。但随着中华绒螯蟹养殖规模的不断扩大，各种疾病日趋严重，给养殖产业造 成了巨大损失。养殖河蟹病害的不断爆发及病因的多样性迫切要求从河蟹本身的免疫防御因 子入手研究其抗病机制和制定新的疾病防治措施。Crustin作为一种重要的针对革兰氏阳性菌 的抗菌肽必将在其免疫防御中发挥着非常重要的作用。

发明内容

本发明的目的是从中华绒螯蟹中克隆到Crustin-1，并对其进行原核重组及重组产物的活 性鉴定，为进一步研究中华绒螯蟹防御机制提供基础，并为中华绒螯蟹的病害防治、基因辅 助选育及进一步开发为医药产品和饲料添加剂奠定基础。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

利用构建cDNA文库，采用RACE技术以及体外重组表达等技术，对中华绒螯蟹Crustin-1 进行了研究，首次从中华绒螯蟹中克隆到Crustin-1，该基因具有序列表中所示的序列。

本发明从中华绒螯蟹中克隆到Crustin-1基因cDNA全长821bp，有一个315bp的开放阅 读框，编码104个氨基酸，5’非编码区长239bp，3’非编码区长267bp，有多聚腺苷酸加尾信 号和多聚腺苷酸尾巴，该基因在中华绒螯蟹免疫防御方面发挥着重要作用。它具有SEQ ID NO. 1所示的序列。利用pET30a(+)表达载体在大肠杆菌origami(DE3)重组表达了该蛋白，表达 产物对藤黄微球菌、四联球菌、枯草杆菌和苏云金芽孢杆菌具有明显的杀菌活性，最小抑菌 浓度分别为：0.12μM、0.46μM、0.23μM和0.12μM；而对革兰氏阴性菌，如大肠杆菌E.coli 和鳗弧菌Vibrio anguillarum均未检测到杀伤活性。

其编码的蛋白具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，分子量为11572.58，等电点为8.43， 其中编码序列的1-21为信号肽序列，成熟肽分子量为9319.71，等电点为8.26。具有典型的 WAP结构域(Lys50-Gln101)。