[发明专利]防止病毒与DLC8结合的新型抗病毒肽

说明书

发明领域

本发明涉及新型抗病毒化合物开发以及它们在预防或治疗动物或人类中的病毒感染中的应用的技术领域。

发明背景

病毒是需要整合特定细胞功能以便可以成功地进行它们在细胞内的复制循环的细胞内寄生虫。已经证明动力蛋白在不同病毒模型如狂犬病毒、人单纯疱疹病毒、I型或人免疫缺陷病毒中在不同的病毒感染步骤中具有相关作用。动力蛋白是微管动力蛋白，其干预与微管和内体途径联系的细胞内转运，并且是在其它功能中细胞内信号翻译的不同途径的调控子。病毒利用动力蛋白用于它们的内在化和细胞内转运，用于形成病毒工厂，在那里将产生新的病毒体，并且用于协调这些和其它过程必需的细胞信号传导。

特别地，非洲猪瘟病毒(ASFV)的p54蛋白与一种细胞蛋白相互作用，该种细胞蛋白作为称为动力蛋白的微管动力复合体的一部分并且其功能主要与细胞内转运相关[1]。在酵母中利用双杂交系统(异源系统)，在病毒p54蛋白可能的相互作用蛋白的猪巨噬细胞cDNA文库中寻找相互作用蛋白，发现了该相互作用。编码p54的序列(E183L基因)包含在BA71V分离株的完整序列中，以登记号U18466存放在NCBI数据库中。对获得且鉴定为阳性的克隆进行测序，以发现它们包含8千道尔顿(kDa)的轻链动力蛋白的完整编码序列，所述8千道尔顿(kDa)的轻链动力蛋白称为DLC8，LC8，DLC1，DNLC1或PIN(神经元氧化氮合酶的抑制剂蛋白)。Susscrofa中编码DLC8的序列已经以AF436777存放在NCBI数据库中。使用另一种形式的技术，包括亲和层析，免疫沉淀和通过共聚焦显微镜的双成分共定位，确证了这些结果。这些结果仅证实ASFV的p54蛋白和DLC8之间的相互作用。

DLC8是在进化上远系物种之间(从线虫动物到人)具有高度保守核苷酸氨基酸序列的蛋白[2，3]。细胞质动力蛋白是驱动遍及微管的不同负荷的分子发动蛋白家族。它们负责将小泡、内体和细胞器由细胞外部转运至内部、至核或核周区域。它们是大的多蛋白复合物，由一至三个具有球状头部和ATP酶活性的重链构成，其负责产生引起运动必需的能量。与这些重链结合的是不定数目的中间体链和轻链。后者负责与待转运的负荷直接相互作用。迄今为止，已经描述了7个轻链家族，其中我们可以找到DLC8。DLC8在体内倾向于成为二聚体，其允许在两个单体之间存在不同序列的两个相同的结合位置。

关于该细胞蛋白，对于DLC8已经发现了两种类型的它们与之相互作用的该细胞蛋白的优先结合位点[12，13]。基序之一(Lys/Arg)XThrThr(X为任何氨基酸)结合DLC8与一系列分子如动力蛋白的中间体链、促凋亡(proapoptotic)分子Bim、Kid1和Swallow转录因子和一些不同来源的病毒蛋白。这一结合位点位于两个DLC8分子的二聚体之间。第二个基序是：Gly(Ile/Val)GlnValAsp，其结合DLC8与神经元氧化氮合酶(nNOS)或与神经元skafolding蛋白，如目前所述。

为了鉴定病毒蛋白与动力蛋白结合所需要的氨基酸残基，在酵母系统中表达并检测p54蛋白的7个剪截的片段，以确定针对DLC8的结合区位于p54蛋白的羧基末端，由在Tyr149和Thr161之间的13个氨基酸组成(TyrThrThrThrValThrThrGlnAsnThrAlaSerGlnThr)[1]。

一些病毒在它们在宿主细胞内的感染周期的不同阶段使用轻链动力蛋白(DLC8)。通过称为pep-扫描的技术，合成了模拟不同病毒来源蛋白的线性序列的肽，印迹至滤纸上，并且用DLC8探测来确定哪种线性序列适于该相互作用[10]。下述出现的线性序列理论上适于DLC8结合。这些通常包含Gln(Q)残基，在该序列中通常与T残基(Thr)相邻：

-非洲猪瘟病毒p54蛋白的TyrAlaSerGlnThr基序

-呼吸道合胞病毒结合糖蛋白的TyrSerThrGlnThr基序

-狂犬病毒的和Mokola病毒的、人单纯疱疹病毒解旋酶的、腺病毒蛋白酶的、或A.moorei昆虫痘病毒的P蛋白的LysSerThrGlnThr基序。

-人乳头瘤病毒(papillovirus)E4蛋白的或痘苗病毒聚合酶的LysGlnThrGlnThr基序。

-人疱疹病毒基因U19的LysGlnThrGlnThr基序

-人柯萨奇病毒(human Coxsackievirus)衣壳蛋白的ArgValMetGlnLeu基序，等等。