[发明专利]一种构建脑心肌炎病毒感染性克隆的方法无效
| 申请号： | 200810225311.2 | 申请日： | 2008-10-29 |
| 公开（公告）号： | CN101386860A | 公开（公告）日： | 2009-03-18 |
| 发明（设计）人： | 杨汉春;盖新娜;郭鑫;张国庆;朱书 | 申请（专利权）人： | 中国农业大学 |
| 主分类号： | C12N15/41 | 分类号： | C12N15/41;C12N15/63 |
| 代理公司： | 北京路浩知识产权代理有限公司 | 代理人： | 王朋飞 |
| 地址： | 100083*** | 国省代码： | 北京;11 |
| 权利要求书： | 查看更多 | 说明书： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 构建 脑心肌炎病毒 感染性 克隆 方法 | ||
【说明书】：
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种构建脑心肌炎病毒 的感染性克隆的方法。
背景技术
脑心肌炎是猪、某些哺乳动物乃至灵长类动物以脑炎、心肌炎或 心肌周围炎为主要临床特征的急性传染病，由脑心肌炎病毒 (Encephalomyocarditis virus，EMCV)引起。EMCV的宿主范围很广， 在多种啮齿类动物、野生动物和灵长类动物均有发现，人也可感染， 但大多数不出现任何症状。猪是感染EMCV最广泛、最严重的动物， 除能引起仔猪致死性心肌炎和脑炎外，还能引起母猪繁殖障碍。
目前国内对猪脑心肌炎尚无有效的治疗药物和疫苗，主要靠综合 性防制措施加以预防。由于EMCV在猪和人之间有密切联系，病毒在 猪体内可引起持续感染，而猪的组织器官又是人体组织器官移植的重 要来源，因此对该病毒的研究越来越受到关注。
EMCV属微RNA病毒科心肌病毒属成员，其基因组为单股正链 RNA，在复制过程中不形成DNA中间体，而大多数基因工程操作技 术都是在DNA分子水平上进行操作，对EMCV的分子病毒学研究因此 受到限制。随着RNA病毒全长感染性cDNA克隆技术的建立，研究者 可以有效利用病毒的全长cDNA为模板，体外转录出感染性RNA，以 拯救RNA病毒。感染性克隆就是指在细菌质粒中含有病毒全基因组的 cDNA拷贝，使得cDNA本身或从cDNA体外转录所得的RNA具有感染 性。感染性克隆提供的全长cDNA模板具有基因型稳定、易操作的特 点，使在基因组水平上研究RNA病毒的单个基因和点突变成为可能， 在研究病毒致病力、病毒各蛋白的功能和病毒复制，甚至在阐明病毒 致病机理以及疫苗研制等方面都是十分有用的工具。
发明内容
本发明的目的是提供一种构建脑心肌炎病毒感染性克隆的方法， 为脑心肌炎病毒的分子病毒学研究和疫苗的研制等提供有效的工具。
本发明构建脑心肌炎病毒的感染性克隆的方法，包括以下步骤：
(1)改造低拷贝质粒载体，使其只含有构建感染性克隆所需的 酶切位点；
(2)提取脑心肌炎病毒的总RNA；
(3)用RT-PCR方法分三个片段扩增脑心肌炎病毒的全长cDNA， 获得的三个片段的cDNA两端分别含有不同的酶切位点；
(4)将三个片段的cDNA分别建立亚克隆；
(5)用双酶切的方法将三个片段的cDNA依次定向克隆至改造的 低拷贝质粒载体中，得到含有脑心肌炎病毒全长cDNA的脑心肌炎病 毒感染性克隆。
其中，用RT-PCR方法分三个片段扩增脑心肌炎病毒的全长cDNA 时，在脑心肌炎病毒的5′端非翻译区前加入T7RNA聚合酶启动子核 心序列，亦能够通过定点突变形成新的酶切位点，作为感染性克隆的 遗传标记，以利于其鉴定。
本发明构建脑心肌炎病毒的方法分三个片段扩增病毒的cDNA， 所扩增的片段相对较短，能够更好地保证所扩增片段序列的保真性， 同时也降低了长片段扩增的操作难度；采用双酶切定向克隆，使连接 的效率和准确性大大提高；在5’非翻译区前加入的T7RNA聚合酶启 动子核心序列能够保证感染性克隆在体外转录时产生高丰度高质量 的mRNA，大大提高了转染的成功率。因此用本发明方法所构建的脑 心肌炎病毒感染性克隆非常稳定，由该感染性克隆拯救出的脑心肌炎 病毒具有侵染性，且拯救病毒的生长特性和在模式动物上的致病性与 其亲本病毒具有较高的一致性。
本发明方法操作难度较小，可控性较强，所获得的稳定的脑心肌 炎病毒感染性克隆使在病毒基因组上进行分子生物学操作变得简单 易行，从而使在感染性克隆基础上以突变、置换、插入、缺失等手段 对脑心肌炎病毒进行基因功能研究成为可能，同时为新型病毒活载体 疫苗的研制提供了必要的平台。
附图说明
图1感染性克隆pWSKBJC3/w全长质粒的构建方案和简略步骤
图2BJC3三个片段A、B、C的RT-PCR扩增产物
图3rVBJC3W和BJC3在BHK-21细胞上产生的细胞病变
图4rVBJC3W遗传标记的酶切鉴定
图5rVBJC3W感染BHK-21细胞的间接免疫荧光检测结果
图6rVBJC3W和BJC3在BHK-21细胞中的生长动力学曲线
图7rVBJC3W和BJC3的小鼠存活曲线
下载完整专利技术内容需要扣除积分，VIP会员可以免费下载。
该专利技术资料仅供研究查看技术是否侵权等信息，商用须获得专利权人授权。该专利全部权利属于中国农业大学，未经中国农业大学许可，擅自商用是侵权行为。如果您想购买此专利、获得商业授权和技术合作，请联系【客服】
本文链接：http://www.vipzhuanli.com/pat/books/200810225311.2/2.html，转载请声明来源钻瓜专利网。
- 同类专利
- 一种基于密码子同义突变的基因序列改造方法及其在疫苗制备中的应用-201910491828.4
- 安子琛 - 安子琛
- 2019-06-06 - 2019-10-08 - C12N15/41
- 本发明公开了一种基于密码子同义突变的基因序列改造方法及其在疫苗制备中的应用。该方法通过对序列中同义密码子进行碱基突变，改造成TTA、TTG、TCA或TCG。这样在基因复制过程中，仅需变异一个碱基就可以形成终止密码子(TAA、TGA、TAG)，由基因变异而引起肽链合成终止的概率也会大大增加，从而可以大大提高物种或病毒的遗传稳定性。在病毒的减毒活疫苗的使用过程中，安全性是最主要的问题，减毒活疫苗毒力返强的风险是一直存在的。在减毒活疫苗的设计中，对病毒基因的密码子进行同义突变改造，可以提高疫苗毒序列的保真性，减少疫苗毒在体内毒力返强的几率，从而提高减毒活疫苗的安全性。
- 塞尼卡谷病毒SVV/CH/NM/2016的全基因组序列及其扩增引物-201810030599.1
- 陈君彦;王秀明;魏学峰;刘国英;关平原;陈九连;范秀丽;张燕红;王云凌;张贵刚;王艳杰;张宸;刘建奇;武瑾贤;谢雪岑;杜宇荣 - 金宇保灵生物药品有限公司
- 2018-01-12 - 2019-09-20 - C12N15/41
- 本发明公开了塞尼卡谷病毒SVV/CH/NM/2016的全基因组序列及其扩增引物。本发明先用一步RT‑PCR方法扩增出SVV/CH/NM/2016株的7个核苷酸序列片段(S1、S2、S3、S4、S5、S6和S7)，然后对7个核苷酸序列片段进行克隆测序，再将7个核苷酸序列片段的DNA序列依次进行拼接、编辑及校正，最终得到塞尼卡谷病毒SVV/CH/NM/2016的全基因组序列。本发明获得的塞尼卡谷病毒SVV/CH/NM/2016全基因组序列有利于塞尼卡谷病毒致病机制、分子流行病学、反向遗传学等的进一步研究，从而对塞尼卡谷病毒的诊断试剂开发、疫苗研制等奠定重要的数据支持和理论基础。
- 塞尼卡谷病毒SVV/CH/ZZ/2016的全基因组序列及其扩增引物-201810032082.6
- 陈君彦;王秀明;魏学峰;刘国英;关平原;陈九连;范秀丽;张燕红;张贵刚;王云凌;王艳杰;张宸;刘建奇;武瑾贤;杜宇荣;谢雪岑 - 金宇保灵生物药品有限公司
- 2018-01-12 - 2019-09-20 - C12N15/41
- 本发明公开了塞尼卡谷病毒SVV/CH/ZZ/2016的全基因组序列及其扩增引物。本发明先用一步RT‑PCR方法扩增出SVV/CH/ZZ/2016株的7个核苷酸序列片段(S1、S2、S3、S4、S5、S6和S7)，然后对7个核苷酸序列片段进行克隆测序，再将7个核苷酸序列片段的DNA序列依次进行拼接、编辑及校正，最终得到塞尼卡谷病毒SVV/CH/ZZ/2016的全基因组序列。本发明获得的塞尼卡谷病毒SVV/CH/ZZ/2016全基因组序列有利于塞尼卡谷病毒致病机制、分子流行病学、反向遗传学等的进一步研究，从而对塞尼卡谷病毒的诊断试剂开发、疫苗研制等奠定重要的数据支持和理论基础。
- 用于制备EV71病毒样颗粒的核酸构建体和方法-201510623237.X
- 袁于人 - 斯澳生物科技（苏州）有限公司
- 2015-09-28 - 2019-08-27 - C12N15/41
- 本发明属于分子生物学、病毒学和免疫学领域，涉及一种用于制备EV71病毒样颗粒的核酸构建体和方法。本发明还涉及包含所述核酸构建体的重组载体和重组宿主细胞。本发明还涉及一种串联共表达EV71病毒衣壳蛋白VP1、VP2、VP3和VP4的方法以及纯化方法、一种制备EV71病毒的病毒样颗粒的方法等。进一步地，本发明还涉及一种EV71病毒样颗粒以及含有它的药物组合物例如疫苗。本发明实现了人手足口病病毒(EV71)衣壳蛋白在大肠杆菌中可溶共表达，并且表达量较高，最终获得的目的蛋白约占菌体可溶总蛋白的10％，其组成的EV71病毒样颗粒与天然的EV71病毒构象高度接近。
- 一种猪脑心肌炎病毒BD2株全长感染性克隆的构建方法及应用-201611048159.6
- 袁万哲;孙继国;戚妍;李佳暖;刘娜 - 河北农业大学
- 2016-11-24 - 2019-08-23 - C12N15/41
- 本发明公开了一种猪脑心肌炎病毒BD2株全长感染性克隆的构建方法及应用。在构建好的猪脑心肌炎病毒BD2株全长感染性克隆的基础上，在编码病毒先导蛋白的L基因中插入猪圆环病毒的ORF2基因，成功构建了一种稳定携带猪圆环病毒2型ORF2基因的脑心肌炎病毒BD2株全长感染性克隆。构建的EMCVBD2株全长感染性克隆以及稳定携带猪圆环病毒2型ORF2基因的脑心肌炎病毒BD2株全长感染性克隆都可以拯救出具有感染性的重组病毒，可应用于疫苗制备及病毒的研究。
- G种肠道病毒诊断抗原及其试剂盒-201610443907.4
- 王新平;鲁海冰;王明月;郭昌明;刘亚静;张群;朱利塞;王芳 - 吉林大学
- 2016-06-21 - 2019-06-25 - C12N15/41
- 本发明公开了一种G种肠道病毒基因VP1，它的碱基序列如序列表SEQ ID NO.1所示，表达的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示的蛋白VP1，作为包被抗原制备的一种用于检测动物血清中G种肠道病毒抗体的间接ELISA试剂盒，安全、灵敏度高、特异性强、操作简便快速、成本低。
- 一种DNA分子与重组病毒及它们的制备方法和用途-201510571639.X
- 秦成峰;赵慧;李月香;邓永强 - 中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所
- 2015-09-09 - 2019-05-10 - C12N15/41
- 本发明涉及生物技术领域，公开了一种DNA分子及其制备方法与应用、重组病毒及其制备方法与应用以及重组蛋白及其编码DNA分子与应用。所述DNA分子含有重组的衣壳蛋白VP1的编码序列，重组的衣壳蛋白VP1的编码序列由串联连接的第一衣壳蛋白VP1的编码序列、短肽的编码序列和第二衣壳蛋白VP1的编码序列组成，第一衣壳蛋白VP1的编码序列和第二衣壳蛋白VP1的编码序列来源于肠道病毒71型的衣壳蛋白VP1的编码序列，短肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。所述重组病毒的基因组RNA对应的cDNA序列与所述DNA分子的序列相同。所述重组蛋白含有串联连接的第一衣壳蛋白VP1的氨基酸序列、短肽的氨基酸序列和第二衣壳蛋白VP1的氨基酸序列。本发明能够制得预防EV71和CA16感染的双价疫苗。
- 塞尼卡谷病毒疫苗及其制备方法和应用-201810003888.2
- 郑海学;杨帆;朱紫祥;刘华南;张克山;田宏;曹伟军;李丹;马旭升;靳野;冯霞;郭建宏;何继军;刘湘涛 - 中国农业科学院兰州兽医研究所
- 2018-01-03 - 2019-02-19 - C12N15/41
- 本发明涉及一种分离的塞尼卡谷病毒核酸、一种塞尼卡谷病毒株、一种包含所述塞尼卡谷病毒株的塞尼卡谷病毒疫苗及其制备方法，以及所述塞尼卡谷病毒疫苗在制备用于预防和/或控制动物塞尼卡谷病毒引起的相关疾病的药物中的用途。
- 一种柯萨奇A16型病毒样颗粒-201310730635.2
- 许丹;陈明杰;仝鑫;田平生;王子龙 - 上海泽润生物科技有限公司
- 2013-12-26 - 2015-07-01 - C12N15/41
- 本发明涉及生物工程领域，具体而言，本发明涉及A16型柯萨奇病毒前体衣壳蛋白P1与3CD，其编码基因，及其制备方法和用途。
- 一种肠道病毒71型可视化重组病毒及其应用-201310363321.3
- 秦成峰;曹瑞源;秦鄂德;韩剑峰;李晓峰 - 中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所
- 2013-08-20 - 2015-03-18 - C12N15/41
- 本发明公开了一种肠道病毒71型可视化重组病毒及其应用。本发明首先保护一种双链DNA分子，为将CCPGCC标签的编码基因插入肠道病毒71型的基因组DNA的3C蛋白酶编码区中得到的DNA分子；所述CCPGCC标签为序列表的序列1所示的多肽片段。含有所述双链DNA分子的表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。本发明还保护一种肠道病毒71型的重组病毒，其基因组RNA的编码DNA如序列表的序列4所示。本发明所提供的肠道病毒71型可视化重组病毒在基础研究方面具有良好的应用前景。
- 一种重组人柯萨奇病毒B组蛋白及其应用-201410098277.2
- 张秀杰;华艳;张晓刚 - 北京英诺特生物技术有限公司
- 2014-03-17 - 2014-06-04 - C12N15/41
- 本发明提供了一种编码重组人柯萨奇病毒B组蛋白的重组DNA，提供了一种重组人柯萨奇病毒B组蛋白，提供了一种重组人柯萨奇病毒B组蛋白的制备方法，提供了一种检测人柯萨奇病毒B组感染的试剂盒，以及提供了一种将所述重组人柯萨奇病毒B组蛋白用于检测人柯萨奇病毒B组感染的用途。本发明的重组DNA具有如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列，本发明提供的重组人柯萨奇病毒B组蛋白制备的诊断试剂盒，与市场上的同类试剂盒相比，具有特异性强、灵敏度高等优点，很好的满足了人柯萨奇病毒B组感染临床诊断的需要。
- 中华鳖小RNA病毒基因组全序列及其应用-201310309961.6
- 潘晓艺;沈锦玉;蔺凌云;姚嘉赟;徐洋;尹文林 - 浙江省淡水水产研究所
- 2013-07-19 - 2013-11-13 - C12N15/41
- 一种分离的核酸分子，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1 所示或其反义序列，且所述核酸分子来源于中华鳖小RNA病毒株CNSR2011。 所述的核酸分子的用途，在于制备检测中华鳖小RNA病毒的引物、探针或试剂盒，还可用于制备中华鳖小RNA病毒疫苗和抗中华鳖小RNA病毒的抗体。
- 肠道病毒71型阜阳株及其减毒株的cDNA感染性克隆及应用-201210130398.1
- 岑山;张永欣;李晓宇;周永东 - 中国医学科学院医药生物技术研究所
- 2012-04-27 - 2013-10-30 - C12N15/41
- 本发明提供了肠道病毒71型阜阳株及其减毒株的cDNA感染性克隆及应用，其是通过反向遗传操作技术构建的EV71型阜阳株及其减毒株的cDNA感染性克隆，为阐明EV71的致病机制，寻找EV71的毒力决定位点以及抗EV71病毒药物的研发和EV71疫苗的研发奠定了重要的基础。
- 检测肠道病毒中和抗体的方法及其专用重组病毒-201110220476.2
- 李文辉;宋子林;陈盼;祁永和;梁争论;吴星;沈心亮 - 北京生命科学研究所
- 2011-08-02 - 2013-02-06 - C12N15/41
- 本发明公开了检测肠道病毒中和抗体的方法及其专用重组病毒。本发明提供了一个DNA分子。本发明所提供的DNA分子，是将肠道病毒的基因组RNA对应的cDNA中的所有结构蛋白的编码基因替换为报告基因得到的重组DNA。本发明利用EV71 FY的假病毒系统检测中和抗体的方法由于采用了单周期感染的假病毒，所以没有使用活病毒时的安全问题。经过多个试验，其结果表明该发明中所陈述的假病毒系统是一种安全，灵敏，快速，特异，简便且成本低廉的检测中和抗体的方法。基于以上特点，该假病毒系统非常适合于快速，大规模地检测中和抗体的试验，对于病毒疫苗的研制及检测患者个体及人群手足口病特异性中和抗体水平有着重要的应用价值。
- 柯萨奇病毒B3型病毒样颗粒的制备方法及其应用-201210349983.0
- 盛望;张潇;赵淼;王晓雯;曾毅;李泽琳;刘伟 - 北京工业大学
- 2012-09-19 - 2013-01-30 - C12N15/41
- 本发明公开了柯萨奇病毒B3型病毒样颗粒的制备方法。本发明所提供的方法包括如下步骤：1）将柯萨奇病毒B3型的VP1基因和VP4基因克隆到目的质粒1中，得到重组表达载体1，将VP2基因和VP3基因克隆到目的质粒2中，得到重组表达载体2；2）用步骤1）得到的重组表达载体1和重组表达载体2共转化目的酵母细胞，得到表达所述VP1基因、所述VP2基因、所述VP3基因和所述VP4基因的重组酵母细胞；3）裂解步骤2）得到的重组酵母细胞，分离得到柯萨奇病毒B3型病毒样颗粒。实验证明，利用本发明所提供的方法，在酵母表达系统中成功的制备了柯萨奇病毒B3型的病毒样颗粒，可将其进一步用于病毒性心肌炎与I型糖尿病候选预防性疫苗和药物组合物。
- 重组肠道病毒71型病毒样颗粒的制备方法与应用-201110257884.5
- 孙新;杨志平 - 北华大学;吉林省中轩生物科技有限公司
- 2011-09-02 - 2012-12-26 - C12N15/41
- 本发明公开了重组肠道病毒71型病毒样颗粒的制备方法与应用。本发明提供了一种用于制备重组病毒样颗粒的DNA分子组合物。本发明所提供用于制备重组病毒样颗粒的DNA分子组合物，由DNA分子I、DNA分子II、DNA分子III和DNA分子IV组成；所述DNA分子I的核苷酸序列如序列表中序列1所示；所述DNA分子II的核苷酸序列如序列表中序列2所示；所述DNA分子III的核苷酸序列如序列表中序列3所示；所述DNA分子IV的核苷酸序列如序列表中序列4所示。本发明所提供的重组肠道病毒71型病毒样颗粒(VLP)在形态上和真实的病毒类似并且不含有潜在的致病病毒基因组，所以为抗病毒疫苗的开发提供了理想的备选方案。
- 重组柯萨奇病毒B3型病毒样颗粒的制备方法及其应用-201210350637.4
- 盛望;张潇;王晓雯;赵淼;曾毅;李泽琳;刘伟 - 北京工业大学
- 2012-09-19 - 2012-12-19 - C12N15/41
- 本发明公开了重组柯萨奇病毒B3型病毒样颗粒的制备方法。本发明所提供的方法包括如下步骤：1）将柯萨奇病毒B3型的P1基因和3CD基因克隆到目的质粒中，得到重组表达载体；2）用步骤1）得到的重组表达载体转化目的酵母细胞，得到表达所述P1基因和所述3CD基因的重组酵母细胞；3）裂解步骤2）得到的重组酵母细胞，分离得到重组的柯萨奇病毒B3型病毒样颗粒。实验证明，利用本发明所提供的方法，在酵母表达系统中成功的制备了柯萨奇病毒B3型的病毒样颗粒，可将其进一步用于病毒性心肌炎与I型糖尿病候选预防性疫苗和药物组合物。
- 一种肠道病毒71衣壳蛋白3重组抗原及其应用-201210083794.3
- 修冰水;张贺秋;陈堃;戴振华;冯晓燕;杨锡琴 - 中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所
- 2012-03-27 - 2012-08-08 - C12N15/41
- 本发明公开了属于病毒检测技术领域的一种肠道病毒71衣壳蛋白3重组抗原及其应用。本发明重组抗原的基因核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。采用基因拼接技术通过退火延伸PCR技术，获得大肠杆菌密码子优化的VP3基因，实现了优化VP3基因在大肠杆菌的高效表达，并通过亲和层析法纯化获得相应的重组EV71-VP3抗原，获得的EV71-VP3抗原能与手足口病患者血清发生特异的免疫反应，与EV71-VP1联合使用能提高手足口病检测的灵敏度，可用于对EV71急性感染的临床诊断。
- 肠道病毒71型cDNA感染性克隆、其构建方法及应用-201210028906.5
- 张永欣;岑山;金奇 - 中国医学科学院医药生物技术研究所
- 2012-02-09 - 2012-07-25 - C12N15/41
- 本发明提供了一种肠道病毒71型cDNA感染性克隆、其构建方法及应用，其是通过反向遗传操作技术构建的我国EV71流行株的感染性克隆，填补了我国EV71标准株的空白，为抗EV71病毒药物的研发及EV71疫苗的研发奠定重要基础。通过对感染性克隆的基因工程改造，可以更好地阐明病毒的致病机制，研究抗病毒的策略。
- 重组柯萨奇病毒A16型病毒样颗粒的制备方法及其应用-201210008528.4
- 盛望;陈琳;王晓雯;曾毅;李泽琳 - 北京工业大学
- 2012-01-12 - 2012-07-04 - C12N15/41
- 本发明公开了重组柯萨奇病毒A16型病毒样颗粒的制备方法。本发明所提供的方法包括如下步骤：1)将柯萨奇病毒A16型的P1基因和3CD基因克隆到目的质粒中，得到重组表达载体；2)用步骤1)得到的重组表达载体转化目的酵母细胞，得到表达所述P1基因和所述3CD基因的重组酵母细胞；3)裂解步骤2)得到的重组酵母细胞，分离得到重组的柯萨奇病毒A16型病毒样颗粒。利用本发明所提供的方法能在酵母表达系统中制备得到柯萨奇病毒A16型的病毒样颗粒，同时较野生型P1基因和3CD基因相比，本发明对P1基因和3CD基因的密码子优化大大提高了柯萨奇病毒A16型的病毒样颗粒在酵母表达系统中的产量，可将其进一步用于生产婴幼儿手足口病候选预防性疫苗和药物组合物。
- 一种肠道病毒71衣壳蛋白1抗原、制备方法及免疫检测试剂-201110097677.8
- 修冰水;陈堃;张贺秋;王国华;宋晓国 - 中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所
- 2011-04-19 - 2011-11-16 - C12N15/41
- 本发明公开了一种采用大肠杆菌优势密码子拼接的肠道病毒71(EV71)衣壳蛋白1(VP1)抗原基因序列。本发明直接由32条短的基因引物片段，通过退火延伸PCR技术，获得改造后的VP1基因，无需EV71病毒模板；改造后的VP1基因具有较高表达量，可以通过纯化获得相应的重组EV71-VP1抗原，较病毒裂解法具有较高的安全性。
- 重组肠道病毒71型病毒VP1抗原的纯化方法-201010202876.6
- 吴强;周林福 - 杭州浙大紫金生物科技有限公司
- 2010-06-17 - 2010-10-13 - C12N15/41
- 本发明涉及基因工程重组蛋白的纯化方法，旨在提供一种重组肠道病毒71型病毒VP1抗原的纯化方法。该方法包括：利用大肠杆菌表达生产重组肠道病毒71型病毒VP1蛋白，得到该蛋白的包涵体；将包涵体溶解于增溶液中；在水浴和磁力搅拌条件下向复性液中逐滴加入包涵体溶液，然后在搅拌复性48小时。本发明提出通过蛋白复性能使以包涵体形式存在的蛋白变成可溶性蛋白，大大提高了表达产物的回收率。采用亲和层析一步纯化，纯度大于95％。纯化的方法操作简单、方便、省时，有利于大规模的工业化生产。具有成本低廉、工艺简便，纯化蛋白纯度高等优点，可以为EV71型诊断试剂的开发和血清流行病学调查提供诊断用抗原。
- 一种密码子优化的EV71 VP1基因及其核酸疫苗-201010126145.8
- 徐娟;王世霞;黄祖瑚;卢山 - 徐娟;王世霞;黄祖瑚;卢山
- 2010-03-16 - 2010-10-06 - C12N15/41
- 本发明属于医药生物技术领域，公开了一种密码子优化的EV71 VP1基因及其核酸疫苗。该EV71 VP1基因兼顾了哺乳动物细胞和大肠杆菌密码子使用偏好，序列为SEQ IDNO.1。在此基础上，将该基因插入到真核表达载体中，构建了核酸疫苗Vector/VP1、Vector/tPA-VP1及Vector/VP1-tandem，三种VP1 DNA疫苗经真核细胞表达和动物免疫验证，均能够较好的表达VP1蛋白，并刺激产生了特异性抗体，体现了良好的免疫原性。
- 肠道病毒71型基因组的序列及其应用-200910106171.1
- 周伯平;杨桂林;刘威龙;陈心春;张明霞;刘映霞;徐六妹 - 深圳市第三人民医院
- 2009-03-23 - 2009-08-19 - C12N15/41
- 一种肠道病毒71型全基因组序列，其具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，所述序列可用于制备预防肠道病毒71型疫苗和用于制备抗肠道病毒71型中和抗体。该序列为进一步获得我国华南地区EV71型遗传衍化特征提供了客观依据，为进一步研制开发针对我国不同地区发病人群的血清学酶联免疫吸附试验(ELISA)诊断试剂和疫苗提供了可靠的数据资料，为深入研究EV71的遗传变异规律及手足口病的致病机制提供了宝贵资源。
- 一种构建脑心肌炎病毒感染性克隆的方法-200810225311.2
- 杨汉春;盖新娜;郭鑫;张国庆;朱书 - 中国农业大学
- 2008-10-29 - 2009-03-18 - C12N15/41
- 本发明涉及一种构建脑心肌炎病毒的感染性克隆的方法，该方法包括以下步骤：提取脑心肌炎病毒总RNA；RT-PCR方法分段扩增其全长cDNA，并分别建立亚克隆；用双酶切的方法将各段cDNA依次定向克隆至低拷贝质粒载体中，即得脑心肌炎病毒感染性克隆。本发明方法的操作难度较小，可控性强，能够获得稳定的脑心肌炎病毒感染性克隆，因而，为脑心肌炎病毒的分子病毒学研究和疫苗的研制提供了有效的工具。
- 专利分类
