[发明专利]一种重组人血清白蛋白的纯化方法及其应用

说明书

技术领域

本发明阐述了一种毕氏酵母表达的重组人血清白蛋白(rHSA)的纯化方法 及在细胞培养法生产人用病毒疫苗中的应用。

背景技术

牛血清白蛋白或人血清白蛋白是细胞培养法生产病毒疫苗中不可缺少的稳 定剂，但牛血清白蛋白由于来源于动物并且有潜在的疯牛病等污染而逐渐被人 血液来源的人血白蛋白所替代。然而同样，血源人血白蛋白不可避免地含有潜 在的病原体感染的危险，同时血源人血白蛋白来源于人血浆而限制了其产量和 批间稳定性，质量不稳定。

WO98/06822 1998年2月19日公开了重组人血清白蛋白(rHSA)用于动物 细胞培养，其中重组人血清白蛋白是用于促进细胞的增长。WO99/12568 1999 年3月18日公开了重组人血清白蛋白与糖、无机盐等组合物用于水痘、带状疱 疹及麻疹、风疹、腮腺炎活病毒的稳定剂。

rHSA的制备方法为本领域技术人员所熟知，EP0612761、EP0570916和 EP0699687中均揭示了一个用基因操作技术重组人血清白蛋白的方法。然而，这 些方法均因步骤多、周期长、成本高而变得复杂，因而难于满足工业放大的经 济要求。申请人自有专利申请CN1496993A和CN1854155A公开了制备疫苗生 产用rHSA的方法。与其他方法相比，该方法所纯化的重组HSA特征的显色物 质及多糖等杂质水平大幅度降低，但内毒素水平难以控制，需要进行进一步优 化处理，控制内毒素、提高收率以得到可工业化的纯化工艺。

发明内容

本发明提供了一种高效的适合工业化的rHSA的纯化方法以及rHSA在制备 病毒疫苗培养基，特别是狂犬病疫苗培养基和狂犬病疫苗制剂中的用途。

本发明是通过下述技术方案实现的：

首先通过申请人自有专利申请技术(CN1854301和CN1854306)构建的基 因工程酵母菌及生产方法获得重组人血清白蛋白发酵液，利用0.5um孔径的陶 瓷膜进行过滤，加热后的上清液经过高盐阳离子交换层析，收获的溶液进行硼 酸盐处理，经过中空纤维处理的溶液按照CN1854155A中的工艺进行疏水交换 层析和弱阴离子交换层析。最后，弱阴离子层析的洗脱组分用已知方法，如超 滤浓缩方法、冷冻干燥方法等制成各种成品。

硼酸盐沉淀的去除方式在专利CN1854155A中描述为离心去除，但实际操 作中离心后料液澄清度低，在生产上动力消耗较大，与专利CN1854155A不同 的是，通过引入中空纤维处理操作，使得发酵上清液在加热时不用加入活性炭， 并且对硼酸盐处理的溶液不用离心操作，从而使操作更加简便。引入中空纤维 的优点：合适孔径的中空纤维可以大幅度降低内毒素含量、滤后料液澄清度好， 并且省去活性炭及离心沉淀对蛋白的吸附，收率提高2-10％。其中中空纤维孔径 为截留分子量100K-0.5um，优选为500K-0.2um。内毒素水平得到稳定控制，以 鲎试剂检测低于0.5EU/mL(产品浓度为100mg/mL)。

除非特别说明，本申请中rHSA的浓度(％)的含义为g/100mL，即每100mL 溶液中rHSA的含量(g)，如rHSA10％的含义为每100mL溶液中rHSA的含量 为10g。

具体地，本发明涉及：

1)一种可工业化的纯化rHSA的方法，包括将含rHSA的发酵液经过陶瓷 膜处理，上清依次经过高盐阳离子交换层析、疏水交换层析和弱阴离子交换层 析，得到纯化rHSA，其特征是：所述经高盐阳离子交换层析的溶液在经硼酸盐 处理后，利用中空纤维柱进行过滤。

2)根据项1)所述的方法，其中中空纤维的孔径为截留分子量100K-0.5um， 优选为500K-0.2um。

3)根据项1)所述的方法，其中弱阴离子交换层析使用的缓冲液包括醋酸 钠、磷酸钠、氯化钠及辛酸钠等，优选为磷酸氢二钠、磷酸二氢钠和辛酸钠， 浓度为10mM-200mM，优选50-100mM。

4)项1)所述方法制备的rHSA，其具备下述特征：蛋白纯度为99％-100％ 单体和二聚体，优选基本上100％单体和二聚体；宿主蛋白残留低于100ppm总 蛋白，优选为10ppm总蛋白；多糖残留低于10ug/mg rHSA，优选为低于1ug/mg rHSA；内毒素含量低于0.85EU/mL(10％rHSA)，优选为0.5EU/mL(10％rHSA)。