[发明专利]一种新型重组病毒载体及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程技术，尤其是涉及一种用编码致病病毒抗原的核苷酸序列和病毒载体序列构建的重组体。

背景技术

乙型肝炎是由人乙型肝炎病毒(Human Hepatitis B virus，HBV)引起的，HBV为DNA双链病毒，主要经血液、密切接触和母婴垂直传播。不同地区，HBV的感染几率及传播方式也不尽相同。感染HBV后，部分患者将发展成为慢性持续性感染状态，有的可能演变为肝硬化或原发性肝细胞癌。目前，据估计，全世界乙肝带毒者约3.5亿人，亚洲地区约2.2亿。我国约有1.3亿人是乙肝病毒携带者，每年用于治疗肝炎的医疗费用约300-500亿元，并且多数感染发生在新生儿或儿童期，由于这一阶段发生的感染早期多无症状，急性期极难被发现，因此90％以上将发展为慢性乙肝患者。目前，对于慢性乙肝患者和乙肝抗原表面携带者来说目前尚无有效的治疗方法。有限的化学疗法虽然能在一定程度上抑制HBV复制，但却不能彻底清除体内的感染病毒。研究发现，乙肝患者的急性和慢性肝病的不同结局很大程度上是由于机体对HBV感染的免疫反应不同所致。在急性乙肝患者体内，针对HBV的细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxicity T lymphocyte，CTL)反应是很活跃的、是多位点和高度特异性的，可迅速清除感染病毒；而慢性乙肝患者和乙肝病毒健康携带者体内针对HBV的特异性CTL应答明显低下，致使病毒持续存在，因此目前学术界认为纠正和克服患者体内的CTL低反应状态可能是机体清除HBV，使患者得到彻底恢复的关键。

CTL是通过什么机理来达到清除HBV的目的的呢？由于HBV cccDNA结构特殊，又具有长期的稳定性，最初一直认为CTL只有通过破坏和杀伤感染的肝细胞才能达到清除病毒的作用。但近年来的研究发现事实并非如此。在HBV转基因鼠模型中，病毒特异性的CTL主要是通过非细胞致病性过程来清除病毒的，只有极小一部分残存病毒的清除是通过CTL介导的细胞凋亡和细胞毒性反应来实现的，整个病毒清除过程中受损肝细胞不足1％。Guidotti在HBV急性感染黑猩猩动物模型中也发现，在急性期，HBV DNA绝大部分被清除，而这个期间并没有肝损害、细胞凋亡及ALT升高。由此可见在HBV急性感染过程中，HBV主要是通过这种非细胞致病性机理清除的。其具体过程为：HBV特异性的CTL识别感染肝细胞表面的病毒靶抗原，随即释放细胞因子，主要是IFN-γ和TNF-α，通过旁分泌机制直接作用于HBV感染肝细胞，激活肝细胞内的抗病毒分子机制。同时，这些细胞因子激活Kupffer细胞，并通过正反馈机制进一步产生更多的TNF-α。这种细胞因子的环境导致细胞内病毒颗粒和病毒RNA的降解。

目前市面上应用的乙肝疫苗是酵母重组乙肝疫苗，主要用于乙肝的预防，不能起到治疗乙肝的作用。蔡雄茂等，2002年，将HBV核心和前S1融合蛋白在大肠杆菌及真核进行表达。陈新春等，2003年，用乙型肝炎病毒核心抗原与前S1抗原融合蛋白诱导小鼠，使其产生免疫反应。

国外进入临床I期和国内外处于实验室阶段的治疗性乙肝疫苗都属于DNA疫苗，DNA疫苗目前存在的问题是外源核酸是否会整合到染色体中引起癌变，能否引起免疫病理作用等问题尚未有确切结论，且疫苗诱发的免疫反应强度较弱。所以应用具宿主范围广、高效转导、稳定、安全、易操作等优点的腺病毒做为载体，则能避免上述缺点。

腺病毒在自然界分布广泛，在许多哺乳动物和畜类中都发现其存在。至今已分离到100种以上不同血清型的各种腺病毒。腺病毒是二十面体病毒壳体结构，其基因组为线性的双链DNA。由于腺病毒做为载体具有高的感染效率和高的外源基因表达水平、同时高滴度重组病毒的制备较简单、容量适合装载大多数外源基因、不整合入靶细胞基因组等等的优点，故腺病毒被广泛用于基因治疗的载体。

发明内容

为解决上述问题，本发明的目的在于提供一种新型重组病毒载体。

为达到上述目的，本发明的技术方案为：一种新型重组病毒载体，该载体包括病毒载体和一条核苷酸序列，所述核苷酸序列编码致病病毒的两个抗原的融合蛋白，所述抗原含有B细胞表位和T细胞表位，该重组载体能使免疫动物产生体液免疫和细胞免疫反应。

所述病毒载体是腺病毒载体、腺相关病毒载体、SV40病毒载体、反转录病毒载体、单纯疱疹病毒载体或痘苗病毒载体。

所述腺病毒载体是缺失性腺病毒载体。

所述核苷酸序列插入至腺病毒的E1、E2、E3或E4区域。

所述腺病毒载体是人腺病毒载体。