[发明专利]一种肝素亲和柱及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种肝素亲和柱及其制备方法和应用。

技术背景

肝素是一类糖胺聚糖，由糖醛酸和葡萄糖胺以1→4键连接起来的重复二糖单位组成的多糖链的混合物；可以作为亲和色谱与离子交换色谱的有效配体。其可以亲和许多生物分子，包括凝血因子和其它血浆蛋白如：脂蛋白、蛋白合成因子、核酸酶以及固醇类激素受体。2-O-硫酸-α-L艾杜糖醛酸及6-O-硫酸N-硫酸-α-D葡萄糖胺是其中的主要单糖，由它们组成的三硫酸二糖的重复单位构成了肝素的所谓“规则区”，是肝素结构的主要部分，另外的单糖残基以很低的频率出现于“非规则区”。成品肝素中，只有三分之一的肝素分子能与A T III结合，这些结合的部分具有抗凝活性，而其余部分则活性很低。研究发现，肝素加速抗凝血酶-丝氨酸蛋白酶反应依赖于一个独特的五糖序列。

肝素亲和柱目前主要由国外Pharmacia公司生产，技术一直没有公布。国内外也有文献报道过多种肝素亲和柱的制备方法。最经典的是用溴化氰活化琼脂糖后连上肝素(如Phamacia公司的heparin sepharose CL 6B产品)，但此方法因溴化氰有剧毒而不宜在实验室中进行，并且形成的化学键易断裂，肝素的活性受偶联的影响也比较大。国内有人将琼脂糖环氧化后直接连接肝素，并用之成功分离纯化了肝生长因子，但这种偶联方式的产品在醇类溶液中不稳定。用还原胺化的方法将肝素偶联上琼脂糖类介质是比较理想的一种方法，原因是还原胺化法偶联的是肝素的末端醛基与胺化琼脂糖上的胺基，不影响肝素的活性中心，从而可以保证所得产品具有较高的亲和性能。国外早在1983年就有人用3种方法将肝素联上琼脂糖进行对比，3种方法中以还原胺化法消耗的肝素量最少，但亲和能力最高；然而当时的方法也有一定的缺陷，就是还原剂氰基硼氢化钠的反应产物有剧毒，对环境有污染以及反应周期长达16天等。国内近期也有人采用不同的方法法制备了肝素琼脂糖凝胶6FF亲和柱(非间接还原胺化)，成功分离纯化了抗凝血酶III(Antithrombin III，AT III)。

发明内容

本发明的目的是提供一种成本低、效果好的肝素亲和柱。

本发明的另一个目的是提供上述肝素亲和柱的制备方法。

本发明还有一个目的是提供上述肝素亲和柱的应用。

本发明采用琼脂糖凝胶6FF介质(国产)作为固相载体，经过环氧化与胺化后与肝素相偶联制备亲和层析柱，降低亲和柱的制备成本，简化制备方法，用普通试剂代替传统制备过程使用的剧毒试剂，与此同时保证亲和柱的稳定性与亲和能力。

本发明的技术方案如下：

一种肝素亲和柱，该肝素亲和柱是通过下列方法制备得到的：琼脂糖凝胶6FF作为固相载体，载体先进行活化，偶联上环氧基团后，再进行胺化偶联上胺基，胺化琼脂糖凝胶6FF与肝素在甲醇中形成中间产物醛亚胺，再进一步还原胺化形成稳定化学键即得肝素琼脂糖凝胶6FF。

所述的肝素亲和柱，该肝素亲和柱是通过下列方法制备得到的：

a.琼脂糖凝胶6FF首先用环氧氯丙烷进行活化，即在水中分别以终浓度为20～30％(v/v)的琼脂糖凝胶6FF、5～10％(v/v)的环氧氯丙烷、0.3～0.5mol/L的NaOH进行混合，37℃反应1-2h，得到环氧化琼脂糖凝胶6FF；

b.取20g环氧化琼脂糖凝胶6FF加1～2倍体积浓氨水(通常为25％-28％)37℃反应1-2h，获得胺化琼脂糖凝胶6FF；

c.胺化琼脂糖凝胶6FF与肝素钠混合物在甲醇中预处理：按1g胺化琼脂糖凝胶6FF中加入30～50mg肝素钠与1～2ml甲醇混合，在氮气环境下室温振摇36-52h，形成醛亚胺；

d.按1g胺化琼脂糖凝胶6FF加20～30mg硼氢化钠比例，将硼氢化钠加入醛亚胺，对醛亚胺还原，得到肝素琼脂糖凝胶6FF。

所述肝素亲和柱的制备方法，该方法包括下列步骤：琼脂糖凝胶6FF作为固相载体，载体先进行活化，偶联上环氧基团后，再进行胺化偶联上胺基，胺化琼脂糖凝胶6FF与肝素在甲醇中形成中间产物醛亚胺，再进一步还原胺化形成稳定化学键即得肝素琼脂糖凝胶6FF。

所述的肝素亲和柱的制备方法，该方法为：

a.琼脂糖凝胶6FF首先用环氧氯丙烷进行活化，即在水中分别以终浓度为20～30％(v/v)的琼脂糖凝胶6FF、5～10％(v/v)的环氧氯丙烷、0.3～0.5mol/L的NaOH进行混合，37℃反应1-2h，得到环氧化琼脂糖凝胶6FF；