[发明专利]西尼罗病毒的引物和探针及一步法实时RT－PCR检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明专利属于生物技术领域，涉及科研、临床和病毒流行病学监测等工作中使用RT-PCR方法对西尼罗病毒RNA的检测和定量分析。具体是针对西尼罗病毒的引物和探针及一步法实时RT-PCR检测试剂盒。

背景技术

西尼罗病毒与人类疾病

西尼罗病毒(West Nile Virus，WNV)病是一种烈性人畜共患疾病，1937年在乌干达北部尼罗河地区首先发现而得名。近年来西尼罗病毒感染在欧洲、中东、西亚和俄罗斯等地区和国家频频发生，成为近年来影响美国最大的传染病。西尼罗病毒是经库蚊等嗜鸟蚊传播，以鸟类为主要动物宿主的黄病毒。人、马和其他哺乳动物在被西尼罗病毒感染的蚊虫叮咬后而发病，轻者出现发热、头痛等流感样症状(西尼罗热)，重者可表现为中枢神经系统症状(西尼罗脑炎)，甚至死亡。

西尼罗病毒的检测

西尼罗病毒的检测方法主要有以下几种：病毒分离与鉴定、血清中和试验(Serum neutralization test，SNT)、酶联免疫吸附检测(Enzyme-linkedimmunosorbent assays，ELISA)、PCR检测等。

病毒分离是病毒性脑炎最基础、最重要的诊断手段。对于新发疾病病例，病毒分离是最有价值的工作，但西尼罗病毒分离需在生物安全4级(P4)条件下进行。血清中和试验(Serum neutralization test，SNT)和酶联免疫吸附检测(Enzyme-linked immunosorbent assays，ELISA)均为免疫学检测方法，敏感性高，但特异性较差，并存在一定的交叉反应。制备单克隆抗体可以增加特异性，但成本较高。PCR检测具有快速、准确的特点，也被广泛用于对西尼罗病毒的检测。目前已经建立的PCR检测方法有：1)Sonja Linke等【Linke，S，Ellerbrok H，Niedrig M，et al.Detection of West Nile virus lineages 1 and 2 by real-timePCR，J.Virol.Methods(2007)，doi：10.1016/j.jviromet.2007.05.021】针对5’非编码区(UTR)的实时PCR(Taqman荧光探针)检测方法，检测灵敏度能达10⁶～10^-1plasmid copies/assay，该方法适合西尼罗病毒的诊断和流行病学研究。2)Jiménez-Clavero MA等【Jiménez-Clavero MA，Agüero M，Rojo G，et al.A newfluorogenic real-time RT-PCR assay for detection of lineage 1 and lineage2 West Nile viruses.J.Vet.Diagn.Invest，2006，18(5)：459-62】用TaqManMGB探针对西尼罗病毒进行了实时RT-PCR检测，敏感性可达10^-2～10^-3pfu/tube。

实时PCR(Real-time PCR)技术

实时PCR技术是近年来发展起来的一种新型的PCR技术，它是在传统PCR反应体系的基础上添加了荧光染料或具有荧光标记的探针，将荧光信号强弱与PCR扩增情况结合在一起，通过监测PCR反应管内荧光信号的变化来实时观测PCR反应进行的情况。实时PCR技术，解决了传统PCR难以对扩增起始模板的量进行测定的难题，避免了传统检测技术样本消耗量大，实验操作繁琐，检测灵敏度低等缺点，并具有快速、避免交叉污染等特点，可以在基因检测、基因表达、SNP分析等领域广泛应用。而TaqMan探针的采用，更增加了检测的特异性和结果的可靠性，是一种方便、快捷、经济的检测方法，尤其适用于科研、临床和病毒流行病学监测等工作。