[发明专利]盐藻中钠磷共转运通道1;2基因、其编码蛋白及其克隆方法

说明书

技术领域

本发明涉及盐藻中钠磷共转运通道1；2基因、其编码蛋白及其克隆方法。

背景技术

盐藻，又叫杜氏藻，它是一种无细胞壁的单细胞真核绿藻，是已知的最耐盐的真核生物。同时，它对光照、环境pH、温度和重金属离子等变化造成的胁迫也能够很好的耐受。因而被广泛的用来研究植物对各种胁迫的反应机制，特别是耐盐胁迫的机制。

磷是所有生物必需的生命元素，生物体对无机磷吸收利用的第一步是通过无机磷转运通道来实现的。本实验室利用SSH技术从盐藻(Dunaliella viridis)中分离到两个受高盐与磷“饥饿”诱导的钠磷共转运通道基因(DvSPT1，DvSPT2)。在功能上，DvSPT1和DvSPT2可能与盐藻细胞中的无机磷的转运，促进甘油合成，维持对外界高渗胁迫的适应有关。

基因复制是基因组进化的一种重要机制，是基因功能多样化的前提，也是物种进化的主要推动力。基因发生复制后积聚突变或者获得新的功能，或者退化成没有功能的假基因。基因功能在具备多样化之前，必需先发生基因复制，由此可见基因复制在进化中的重要性。

发明内容

本发明的目的之一是提供盐藻钠磷共转运通道1；2基因(DvSPT1；2)。

本发明的目的之二在于提供该基因的编码蛋白。

本发明的目的之三在于提供该基因的克隆方法。

为达到上述目的，本发明通过“鸟枪”法测序盐藻BAC克隆DNA，得到了一段连续的盐藻基因组序列，根据在NCBI的核酸库中的Blastn比对发现，获得了盐藻钠磷共转运通道1；2基因(DvSPT1；2)。

本发明采用如下技术方案：

一种盐藻钠磷共转运通道1；2基因，其特征在于该基因具有SEQ NO 1所示的碱基序列。

上述的盐藻钠磷共转运通道1；2基因编码蛋白，其特征在于具有SEQ NO 2所示的氨基酸序列。

上述的盐藻钠磷共转运通道1；2基因的克隆方法，其特征在于该方法具有如下步骤：

a.根据NCBI GenBank DvSPT1(DQ286760)的基因组序列设计下列引物：5′ACTGGTCCACAGACAAGAAGG  3′与5′TCTCAGCATCACGAGCCATA

3′；通过四维PCR筛选体系从盐藻BAC文库得到一个含有盐藻钠磷共转运通道基因的BAC克隆，并构建该BAC克隆的鸟枪文库；

b.从步骤a中构建的鸟枪文库中，大通量提取鸟枪文库的质粒DNA，在MegaBACE 4500上进行序列的测定；每个鸟枪质粒利用M13正反向引物，进行双向测序；共测序600个鸟枪文库质粒，即6块96孔板；

c.将上述的600个鸟枪文库质粒的原始数据输入在RedHat Linux平台的并联计算机群中，使用Phred/Phrap/Consed程序拼接所测序列，构建亚克隆并测序以填补出现在序列之中的缺口，得到一段连续的盐藻基因组序列。通过Blastn程序(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)在该连续的盐藻基因组序列中，获得盐藻钠磷共转运通道1；2基因的全长基因组序列，长度为7973bp。

本发明通过对盐藻BAC克隆DNA的“鸟枪”法测序，在连续的盐藻基因组序列中发现盐藻钠磷共转运通道1基因(DvSPT1)和不同于已知的盐藻钠磷共转运通道1；2基因(DvSPT1；2)。它们可能起源于盐藻基因组序列的复制，并且在6个不同盐稳态条件下DvSPT1；2的表达量要大于DvSPT1，它们的表达趋势也发生了分化。当盐藻处在极端高盐浓度条件下(5M NaCl)时，DvSPT1；2可能担负起主要功能，它增加了盐藻对于更宽盐浓度的适应性。而DvSPT1；2响应高盐或磷“饥饿”胁迫时的诱导表达趋势与DvSPT1类似，在功能上可能与盐藻细胞中的无机磷的转运，促进甘油合成，维持对外界高渗胁迫的适应有关。本发明在研究植物抗盐机制上具有一定的理论意义。

附图说明

图1显示了BAC DNA序列的Blastn比对结果示意图，图中两个箭头所指匹配到序列都是盐藻钠磷共转运通道基因(Dunaliella viridis sodium-coupled phosphatetransporter protein gene)，它们在GenBank中的序列号都是：DQ286760。左侧箭头所指序列是DvSPT1，右侧箭头所指序列是DvSPT1；2。