本发明提供了一种重组猪瘟病毒NS3蛋白、ELISA试剂盒及其应用,首先通过将CSFV全基因序列中的NS3编码区序列克隆到pET32a-Intein-ELK16质粒载体上并表达后再诱导切割,通过离心收集上清得到重组猪瘟病毒NS3蛋白,该重组猪瘟病毒NS3蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示;其次,以该重组猪瘟病毒NS3蛋白为基础建立ELISA试剂盒以用于鉴别猪瘟病毒和重组腺病毒疫苗方面的应用。本发明的重组猪瘟病毒NS3蛋白纯化效率高,反应性好,花费小、操作流程简单、能够规模化生产。该重组猪瘟NS3和重组腺病毒配套使用,可以用来区分全病毒和重组腺病毒激发机体产生的抗体,对NS3抗体的快速检测具有重要意义。