本发明涉及实蝇检疫技术,具体涉及一种检疫性实蝇多目标快速鉴定方法,包括如下步骤:提取待测样品的基因组DNA;以基因组DNA为模板,利用SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的特异性引物进行PCR;凝胶电泳检测PCR产物,若出现603bp的特异性条带,则该样品属于检疫性实蝇;反之,则该样品不属于检疫性实蝇。所述检疫性实蝇指按实蝇属、果实蝇属、咔实蝇属、小条实蝇属、寡鬃实蝇属和/或绕实蝇属;所述特异性引物能将所述检疫性实蝇与其它实蝇科以及双翅目近缘物种区分开,通用性强,为有效防控检疫性实蝇的传入和扩散,保护我国生态安全提供了强有力的技术支撑