[发明专利]重组人白细胞介素—18的工程菌直至产物的制备方法

摘要

一种重组人白细胞介素-18(IL-18)的工程菌及其产物的制备方法，包括人白细胞分离，白细胞总mRNA分离；人工合成含有限制性内切酶切点的引物；RT-PCR基因扩增；IL-18cDNA克隆；转化进入大肠杆菌；工程菌中产物高效表达；IL-18的纯化。由于采用含有限制性内切酶切点的引物，准确获得含有474个核苷酸的IL-18基因。使用大肠杆菌偏爱的终止密码子提高表达率、采用高扩增培养基，表达量高，使得一步纯化即可获得医用针剂纯的产品。

主权项

1.一种重组人白细胞介素-18(IL-18)工程菌直至产物的制备方法，其特征在于它包括以下几个步骤：①人外周血中白细胞的分离；②白细胞中总mRNA的分离；③人工合成含有限制性内切酶切点的引物，在合成的上游引物中导入EcoRI位点，在合成的下游引物中导入BamHI位点，其引物的序列为：PL5′CGGAATTCAAAATGTACTTTGGCAAGCTTGAA3′PR3′GCGGATCCTTAGTCTTCGTTTTGAACAG5′④RT-PCR基因扩增：在含有合成引物的存在下，以mRNA为模板，通过RT-PCR基因扩增，获得IL-18基因片段，其核苷酸序列和相应的氨基酸序列为：10ATGTACTTTGGCAAGCTTGAATCTAAATTATCAGTCATAAGAMYFGKLESKLSVIR20AATTTGAATGACCAAGTTCTCTTCATTGACCAAGGAAATCGGNLNDQVLFIDQGNR3040CCTCTATTTGAAGATATGACTGATTCTGACTGTAGAGATAATPLFEDMTDSDCRDN50GCACCCCGGACCATATTTATTATAAGTATGTATAAAGATAGCAPRTIFIISMYKDS6070CAGCCTAGAGGTATGGCTGTAACTATCTCTGTGAAGTGTGAGQPRGMAVTISVKCE80AAAATTTCAACTCTCTCCTGTGAGAACAAAATTATTTCCTTTKISTLSCENKIISF90AAGGAAATGAATCCTCCTGATAACATCAAGGATACAAAAAGTKEMNPPDNIKDTKS100110GACATCATATTCTTTCAGAGAAGTGTCCCAGGACATGATAATDIIFFQRSVPGHDN120AAGATGCAATTTGAATCTTCATCATACGAAGGATACTTTCTAKMQFESSSYEGYFL130140GCTTGTGAAAAAGAGAGAGACCTTTTTAAACTCATTTTGAAAACEKERDLFKLILK150AAAGAGGATGAATTGGGGGATAGATCTATAATGTTCACTGTTKEDELGDRSIMFTV158CAAAACGAAGACTAAQNED*⑤IL-18cDNA克隆和大肠杆菌转化：经EcoRI和BamHI酶切的pBV220载体和IL-18cDNA连接，并转化至感受态的大肠杆菌中，经抗性培养基筛选，得阳性克隆的大肠杆菌，即IL-18工程菌。⑥将工程菌扩增培养，热激表达、破壁、破包含体；IL-18纯化。