[发明专利]一种转座子介导的高效非病毒真核细胞稳定转染方法有效
| 申请号： | 201911113440.7 | 申请日： | 2019-11-14 |
| 公开（公告）号： | CN110734929B | 公开（公告）日： | 2022-11-22 |
| 发明（设计）人： | 周晓荣;丁晓凌;汪晓莺 | 申请（专利权）人： | 南通大学 |
| 主分类号： | C12N15/85 | 分类号： | C12N15/85 |
| 代理公司： | 北京科家知识产权代理事务所(普通合伙) 11427 | 代理人： | 徐思波 |
| 地址： | 226019 *** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | 本发明提供一种转座子介导的高效非病毒真核细胞稳定转染方法，其特征在于通过构建了同时表达目的基因和转座酶SB100X的载体系统，在简化实验操作的同时，在真核细胞中提高了转座子介导的稳定转染效率。更具体的，本发明通过构建了单载体SB‑2in1‑DEST，用GFP为目的基因来测试，使稳定转染GPF的细胞比例比转座子双载体系统提高了约2.5倍，证明本发明的转染方法能显著提高非病毒稳定转染的效率。而且，本发明构建的SB‑2in1‑DEST载体，可以采用Gateway系统方便地将目的基因克隆进去，简化了克隆所需的技术和时间。 | ||
| 搜索关键词： | 一种 座子 高效 病毒 真核细胞 稳定 转染 方法 | ||
【主权项】：
1.一种转座子介导的高效非病毒真核细胞稳定转染方法，其特征在于安全和高效，包括如下步骤：/n（1）利用基因合成技术和服务，根据已经公开发表的DNA序列，以pbluesript载体为模版，合成EF1启动子驱动的SB100X表达载体，即EF1-SB100X载体，测序鉴定序列的准确性；/n（2）利用基因合成技术和服务，根据已经公开发表的DNA序列，以pbluesript载体为模版，构建两端具有末端重复序列ITR的目的基因，即ITR-CMV-GFP载体，测序鉴定序列的准确性；/n（3）利用PCR技术，借助pbluesript载体的多克隆位点，构建SB-2in1-DEST载体，测序鉴定序列的准确性；/n（4）利用Gateway技术，将表达目的基因的Entry克隆和SB-2in1-DEST重组，构建出SB-2in1-GFP载体，该载体包含了ITR-CMV-GFP和EF1-SB100X序列，测序鉴定序列的准确性；/n（5）转化EF1-SB100X、ITR-CMV-GFP或SB-2in1-GFP载体到DH5α感受态菌种；/n（6）挑取单个的菌克隆，在3-5ml含100ug/ml氨苄青霉素LB培养基中扩增16小时，提取质粒，再次测序验证序列的准确性；/n（7）验证后的克隆在100ml含100ug/ml氨苄青霉素LB培养基中扩增16小时，采用PureLinkHiPure Plasmid Midiprep Kit试剂盒提取转染级的质粒，测量DNA浓度和纯度；/n（8）采用Lonza的Electroporation and Nucleofector在所选择的真核细胞中同时转染两个质粒或SB-2in1-GFP质粒；/n（9）转染后细胞扩增10天，然后利用流式细胞仪鉴定各组稳定转染的细胞比例。/n
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