[发明专利]一种基于差速离心法的细胞外泌体提取工艺

摘要

本发明涉及外泌体提取工艺技术领域，提供一种基于差速离心法的细胞外泌体提取工艺，本发明用于培养HEK‑293细胞的培养优选为高糖型的DMEM培养基，能够有效的解决HEK‑293细胞在培养过程中贴壁强度比较小的问题，进而使培养基中的HEK‑293细胞于同一个位置生产，便于将HEK‑293细胞分离出来；在培养HEK‑293细胞的过程中，向DMEM培养基中加入了10％的马血清，能够给体外培养的细胞提供一个类似生物体内的环境，而且马血清中也包含了一些动物的激素和酶，可以促进HEK‑293细胞的发育和生长；本发明在进行差速离心前先对HEK‑293细胞进行步骤S1、S2和S3的处理，能够对细胞内提取的上清液进行浓缩，并在浓缩后对上清液进行收集，从而能够在一定程度上提高提取物中外泌体的纯度，使提取效果更好。

主权项

1.一种基于差速离心法的细胞外泌体提取工艺，其特征在于，包括以下步骤：/nS1、取HEK-293细胞培养于DMEM培养基中，培养基在使用前加入10％马血清，然后将细胞置于含5％CO2的孵箱内培养，每4-6天传代一次；/nS2、观察S1中HEK-293细胞生长情况，待细胞融合度达到90％左右时弃去原有的培养基，使用PBS缓冲液清洗三遍后，加入DMEM培养基，并将其置于37℃条件下培养24-36h，培养后收集上清液；/nS3、取100mLS2中的上清液于4℃条件下3000×g离心15-20min，去除死亡细胞，将剩余的上清液移入离心超滤器中，于4℃条件下水平转子4000×g离心浓缩约至1mL；/nS4、将经过S3处理后的上清液经10000×g离心30-40min，去除细胞碎片和死亡细胞的细胞核线粒体等杂质，留上清液；/nS5、将S4中的上清液经100000-120000×g离心70-80min，去除上清液留沉淀；/nS6、向S5中的沉淀内加入1mL1×PBS缓冲液进行冲洗吹打重悬，然后经100000-120000×g离心70-80min，离心后弃干净上清液，所得沉淀即为外泌体；/nS7、将S6中的外泌体分别在4℃和-80℃的条件下进行短期和长期储存。/n