[发明专利]一种用于检测心肌肌钙蛋白I的光电化学免疫传感器的制备方法

摘要

本发明涉及一种用于检测心肌肌钙蛋白I的光电化学免疫传感器的制备方法。本发明以构建拼合式光电化学传感器的方式，免疫分析与光电测试分开，实现光电测试与生物分子的免疫识别过程互不干扰的目的。以硫化铋纳米棒修饰的三氧化钨作为基底材料提供基础的光电响应，二者带隙结构匹配，能够很好的利用可见光。其次在96微孔板中进行抗原与抗体的特性免疫识别，利用硫化镉封装包覆有抗坏血酸的介孔二氧化硅标记心肌肌钙蛋白I第二抗体，硫化镉通过二硫键与介孔二氧化硅进行牢固的结合，当滴入二硫苏糖醇之后，断开硫化镉与二氧化硅之间的二硫键，抗坏血酸得以释放，依此在不同程度上提高光电流，实现对心肌肌钙蛋I的灵敏检测。其检测限为0.17 pg/mL。

主权项

1.基于一种用于检测心肌肌钙蛋白I的光电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：/n（1）三氧化钨材料的制备/n取1.0 ~ 2.0 g氯化钨溶于35 ~ 50 mL无水乙醇中，在室温下搅拌1 ~ 2 h后，将混合溶液转移至高压反应釜中于120 ~ 180 °C下反应4 ~ 8 h，反应结束后自然冷却至室温，之后产品用无水乙醇和超纯水各洗涤3次，洗涤结束后，产品于40 ~ 60 °C下干燥10 ~ 12 h，制得海胆状的三氧化钨材料；/n（2）硫化铋纳米棒材料的制备/n取1.5 ~ 2.0 g五水合硝酸铋溶于20 ~ 30 mL乙二醇中，于室温下搅拌20 ~ 30 min，此溶液作为溶液A；取1.2 ~ 1.5 g九水合硫化钠溶于20 ~ 50 mL超纯水中，于室温下搅拌10 ~ 20 min，此溶液作为溶液B；取1.8 ~ 2.0 g尿素溶于10 ~ 40 mL超纯水中，于室温下搅拌均匀，此溶液作为溶液C；将溶液B加入溶液A中，得到黑色混合溶液，搅拌5 min后，将溶液C逐渐加入上述混合溶液中，于室温下搅拌均匀后，转入高压反应釜中，于150 ~ 200 °C下水热反应20 ~ 28 h，反应结束后自然冷却至室温，之后产品用无水乙醇和超纯水各洗涤3次，最后产品于40 ~ 60 °C下干燥过夜，得到棒状的硫化铋纳米材料；/n（3）介孔二氧化硅纳米材料的制备/n取0.1 ~ 0.5 g十六烷基三甲基溴化铵溶于200 ~ 250 mL超纯水中，之后向溶液中加入1.0 ~ 2.0 mL浓度为0.5 ~ 3 mol/L的氢氧化钠水溶液，该混合溶液于70 ~ 100 °C下搅拌均匀后，向溶液中逐滴加入1 ~ 3 mL的正硅酸四乙酯溶液，继续搅拌1 ~ 5 h，搅拌结束后自然冷却至室温，产品用无水乙醇和超纯水各洗涤3次，之后产品于50 °C下真空干燥过夜，所得到的固体粉末材料继续在400 ~ 600 °C下高温煅烧4 ~ 7 h，以除去多余的表面活性剂，得到介孔二氧化硅纳米材料；/n（4）巯基乙酸功能化的硫化镉量子点的制备/n取0.08 ~ 0.10 g四水合硝酸镉溶于200 ~ 300 mL超纯水中，搅拌均匀后，加入100 ~200 µL的巯基乙酸溶液，得到浑浊的淡蓝色溶液后，用0.01 ~ 0.02 mol/L的氢氧化钠水溶液调节pH至9 ~ 11，之后加入5 ~ 20 mL溶有0.03 ~ 0.05 g的九水合硫化钠水溶液，遮光搅拌10 ~ 30 min后，混合溶液用无水甲醇和超纯水洗涤得到淡黄色产品，之后于40 ~ 70°C下真空干燥过夜，得到巯基乙酸功能化的硫化镉量子点材料；/n（5）PBS缓冲溶液的配置/n取11.94 g十二水合磷酸氢二钠定容于500 mL的容量瓶中配置成浓度为1/15 mol/L的水溶液，作为甲液；取4.54 g磷酸二氢钾定容于500 mL的容量瓶中配置成浓度为1/15 mol/L的水溶液，作为乙液；将甲液和乙液按比例混合，配置成一系列pH在5.0 ~ 8.0的PBS缓冲溶液；/n（6）硫化镉封装包覆抗坏血酸的介孔二氧化硅复合材料的制备/n取0.5 ~ 1 g介孔二氧化硅材料溶于40 ~ 70 mL无水甲醇溶液中，之后向溶液中加入0.1 ~ 0.3 g的2-（吡啶基二硫烷基）乙胺，于室温下搅拌12 ~ 24 h，以实现在介孔二氧化硅表面二硫键的连接，之后产品用无水乙醇和超纯水各洗涤3次，于35 °C下真空干燥；干燥后的材料溶于含有0.1 ~ 0.3 g的抗坏血酸的10 mL的PBS缓冲溶液中，于室温下震荡12 ~24 h后，向溶液中加入0.01 ~ 0.03 g所合成的巯基乙酸功能化的硫化镉量子点和0.03 ~0.06 g的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC），在室温下继续震荡12 ~ 24h，反应结束后，产品用PBS缓冲溶液洗涤3次，冷冻干燥，得到硫化镉封装包覆抗坏血酸的介孔二氧化硅复合材料；/n（7）硫化镉封装包覆抗坏血酸的介孔二氧化硅标记心肌肌钙蛋白I二抗的制备/n取1 ~ 5 mg所制备的硫化镉封装包覆抗坏血酸的介孔二氧化硅溶于1 ~3 mL、pH为7.0的PBS缓冲溶液后，加入100 ~ 300 μL浓度为5 ~ 20 μg/mL的心肌肌钙蛋白I二抗，于10 ~40 °C下震荡2 ~ 5 h后，离心，用PBS缓冲溶液洗涤3次，产物溶于2mL的PBS缓冲溶液中于4°C冰箱中储存备用；/n（8）光电化学传感器的制备/n1）将导电玻璃依次用洗洁精、丙酮、乙醇和超纯水超声清洗，氮气吹干；/n2）取6 µL、2 ~ 6 mg/mL的三氧化钨的水溶液滴加到ITO导电玻璃的导电面，红外灯下晾干；/n3）在修饰的电极表面继续滴加6 µL、2 ~ 6 mg/mL的硫化铋的水溶液，电极于室温下自然晾干；/n4）取200 µL浓度为5 ~ 20 μg/mL的心肌肌钙蛋白I捕获抗体滴入96微孔板中，于4 °C条件下放置10 ~ 14 h以保证抗体与96微孔板牢固结合，抗体孵化结束后，吸出未结合的心肌肌钙蛋白I抗体，用PBS缓冲溶液小心清洗96微孔板；/n5）取100 µL用PBS配制的质量分数在1 ~ 3 %的牛血清白蛋白滴于96微孔板中，于室温下孵化1小时，之后吸出未结合的牛血清白蛋白，用PBS清洗96微孔板；/n6）取200 µL浓度为0.0005 ~ 200 ng/mL的心肌肌钙蛋白I抗原滴于96微孔板中，在室温下孵化1 h，之后用PBS缓冲溶液清洗96微孔板；/n7）取200 µL浓度为5 ~ 20 μg/mL带有硫化镉封装包覆抗坏血酸的介孔二氧化硅标记的心肌肌钙蛋白I二抗滴于96微孔板中，室温下孵化1 h后，用PBS缓冲溶液冲洗96微孔板；/n8）取50 µL用PBS缓冲溶液配制的浓度为10 ~ 20 mmol/L的二硫苏糖醇滴入96微孔板中，作用10 ~ 30 min；/n9）将96微孔板中的溶液吸出，注入5 mL的PBS缓冲溶液中作为光电测试的电解质溶液，将修饰的硫化铋/三氧化钨/导电玻璃电极浸入该电解质溶液中，制得一种检测心肌肌钙蛋白I抗原的光电化学传感器。/n