[发明专利]一种嗜水气单胞菌噬菌体分离方法

摘要

本发明公开了一种嗜水气单胞菌噬菌体分离方法，首先，广泛地采取污水废水、排泄物以及各种养殖水体；接下来，从这些水体中进行细菌分离，明确水体存在嗜水气单胞菌，由于噬菌体的广泛存在性，因此认为此水体中必定含有嗜水气单胞菌噬菌体；最后，利用已得到的嗜水气单胞菌为宿主菌，从相应的水体或者环境中分离嗜水气单胞菌噬菌体，成功分离得到嗜水气单胞菌噬菌体。相对于目前普遍存在的噬菌体分离技术，此技术更加快捷准确，实验周期短，实验操作要求不高，并且极大地提高了噬菌体分离的成功率，具有相当高的实际应用性和应用前景。

主权项

1.一种嗜水气单胞菌噬菌体分离方法，其特征在于按照以下步骤进行：/n步骤1：培养基及试剂/n1.5％TSB固体培养基、0.5％TSB半固体培养基、3×TSB液体培养基、TSB液体培养基、SM缓冲液；/n步骤2：水样的采集与处理/n获得水样后将其上下颠倒混匀，取30ml水样于50ml离心管中，4℃环境下9000rpm离心30min，得到上清与沉淀，噬菌体存在于上清中，而嗜水气单胞菌存在于沉淀中，取上清液置于一新的50ml离心管，向上清液中加入CaCl至终浓度1mmol/L，溶解后过0.22μm滤膜除去杂菌，将滤液放入冰箱4℃冷藏备用，将沉淀用适量PBS磷酸缓冲盐溶液重悬，利用涂布法在含1.5％TSB固体培养基平板上涂布，在培养箱中28℃过夜培养；/n步骤3：噬菌体的富集/n取滤液约15ml，加入3×TSB液体培养基以及1ml培养至对数期的嗜水气单胞菌菌液，混合后置于无菌三角摇瓶中，于振荡培养箱中28℃，200rpm过夜培养，取上述培养物于50ml无菌离心管中，在4℃条件下9000rpm离心30min，将上清液过0.22μm滤膜除去细菌，将滤液4℃保存以备用；/n步骤4：噬菌体的分离/n采用传统的双层平板法进行嗜水气单胞菌噬菌体分离的验证，下层培养基为含1.5％TSB的固体培养基，上层培养基为含有0.5％TSB的半固体培养基；/n(1)制备底层平板；将融化的无菌1.5％TSB固体培养基均匀地倒入平板中，冷却后置于4℃冰箱保存；/n(2)取400μl培养至对数期嗜水气单胞菌菌液与4ml 0.5％TSB半固体培养基混合均匀，将其均匀倒入已制备好的底层平板中，待其冷却；/n(3)取10μl 2.3中滤液滴在制好的双层平板上，静置30min待其水分蒸发之后，于培养箱中28℃过夜培养，双层平板上出现大块透明斑点即为分离出的嗜水气单胞菌噬菌体。/n