[发明专利]一种基于原位信号放大的夹心型前列腺特异性抗原光电化学免疫分析方法

摘要

本发明公开一种基于原位信号放大的夹心型前列腺特异性抗原光电化学免疫分析方法。将TiO₂‑B与壳聚糖、银离子相复合形成复合物TiO₂‑@CS‑Ag⁺，将其再与二抗结合形成标记的二抗。在H₂O₂存在的情况下，催化S₂O₃^2‑氧化生成S^2‑，S^2‑与探针端的Ag⁺结合，原位生成Ag₂S。由于Ag₂S的禁带宽度比TiO₂‑B小，当光照射到电极表面，受到光的激发，Ag₂S价带上的电子向导带转移，形成电子‑空穴对，Ag₂S导带上的电子富集，转移到TiO₂‑B的导带，使得光生电子‑空穴复合更慢，光电信号增强。随着待测物浓度的增加，由于免疫反应的发生，固定到电极表面的标记过的二抗浓度相应增加，在H₂O₂的存在情况下，S₂O₃^2‑发生还原反应生成S^2‑与Ag⁺结合生成Ag₂S，进一步放大光电信号。基于该现象可建立起对前列腺特异性抗原的无毒光电分析方法。

主权项

1.一种基于原位信号放大的夹心型前列腺特异性抗原光电化学免疫分析方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）玻碳电极（GCE）的预处理：GCE首先在铺有氧化铝粉末的麂皮上机械打磨抛光，用二次水洗去表面残留粉末，再移入超声水浴中清洗，直至清洗干净，最后依序用乙醇，稀酸和水彻底洗涤；（2）GCE/Au/Ab₁/PSA修饰电极的制备： 滴加3μL金锥 （Au NCs）溶液于干净的玻碳电极表面，在红外灯下烘干，冷却至室温；将3μL 0.2 mg/mL巯基苯硼酸溶液滴涂到修饰电极表面，在4°C下孵育50min， 用二次水清洗，去除多余的溶液；将此修饰电极浸泡于浓度为1 mg/mL 的前列腺特异性抗原一抗（Ab₁）溶液中4°C下孵育50 min，随后使用pH 7.4的PBS去除多余的前列腺特异性抗原一抗（Ab₁）;再将此修饰电极浸入浓度为1.0 wt.%的BSA 40 min，以封闭电极表面非特异性活性位点，用二次水冲去表面残余液后将电极浸入不同浓度的前列腺特异性抗原（PSA）溶液中于4°C下孵育50min；用Ph=7.4的PBS冲洗电极表面冲去表面残余液后在室温条件下自然晾干，即得到GCE/Au/Ab₁/PSA修饰电极;（3）GCE/Au/Ab₁/PSA/Ab₂‑TiO₂‑B@CS‑Ag₂S修饰电极的制备：将100 μL 3 mg/mL的TiO₂‑B悬浮液与200 μL 1 mg/mL壳聚糖溶液混合，摇匀30min，反应好的溶液5000r/min转速下离心10min，去除多余的壳聚糖溶液，再加入200 μL的二次水分散，形成TiO₂@CS溶液；将上述混合溶液与200 μL 0.1 M AgNO₃溶液混合，摇匀反应30min，使Ag⁺充分吸附到TiO₂‑B表面，通过离心去除多余的Ag⁺用400 μL二次水再次分散均匀得到TiO₂‑B@CS‑Ag⁺溶液；将200 μL TiO₂‑B@CS‑Ag⁺溶液与600 μL 1 mg/mL的前列腺特异性抗原二抗（Ab₂）混合，在4°C下反应2h，离心去除未吸附的前列腺特异性抗原二抗（Ab₂），用600 μL pH=7.4的PBS再分散，再加入50 μL1.0 wt.%的BSA溶液封闭非活性位点，得到标记的二抗Ab₂‑TiO₂‑B@CS‑Ag⁺；将步骤（2）制得的GCE /Au / Ab₁/PSA修饰电极浸入不同浓度的前列腺特异性抗原（PSA）标准溶液与标记的二抗Ab₂‑TiO₂‑B@CS‑Ag⁺混合溶液中于4°C下孵育50min，利用竞争反应结合固定在电极表面并用pH=7.4的PBS冲洗电极表面，在室温条件下自然晾干得到GCE/Au/Ab₁/PSA/Ab₂‑TiO₂‑B@CS‑Ag⁺修饰电极; 在室温下，将5μL 0.26M的H₂O₂与5μL 0.18M的S₂O₃^2‑溶液一起滴涂到修饰的GCE/Au/Ab₁/PSA/Ab₂‑TiO₂‑B@CS‑Ag⁺电极表面，反应15min，在H₂O₂与TiO₂‑B@CS的催化作用下，原位生成Ag₂S即可得到GCE/Au/Ab₁/PSA/Ab₂‑TiO₂‑B@CS‑Ag₂S修饰电极；（4）前列腺特异性抗原的检测：采用三电极体系进行测定，以GCE/Au/Ab₁/PSA/Ab₂‑TiO₂‑B@CS‑Ag₂S修饰电极为工作电极，Ag/AgCl为参比电极，铂丝电极为辅助电极，利用光电化学工作站进行检测，设置电压为‑0.1，每隔10s进行开关灯，氙灯发射的单色光激发光源使用前由单色仪过滤；在pH=7.4的 PBS中，通过光电化学工作站进行检测10^‑6 ng/mL–50 ng/mL之间的一系列不同浓度的前列腺特异性抗原标准溶液，通过记录开关灯前后产生的不同电流信号，绘制工作曲线；待测样品溶液代替前列腺特异性抗原标准溶液进行检测，检测的结果通过工作曲线查得。