[发明专利]一种膀胱内尿液细菌基因组DNA的提取方法

摘要

本发明公开了一种膀胱内尿液细菌基因组DNA的提取方法，主要包括尿液样品采集、离心提取沉淀物、细菌细胞的溶解、磁珠提取液提取DNA、磁珠提取液的洗脱、PCR扩增及产物的DNA电泳检测等步骤。该方法是针对膀胱尿液中微生物含量低、现有的肠道样品细菌DNA提取试剂盒在提取膀胱尿液DNA时无法提取足够量的DNA以用于后续研究的现状设计的，针对性强，步骤简单易操作，提取效率高。

主权项

1.一种膀胱内尿液细菌基因组DNA的提取方法，其特征在于，具体包括如下步骤：1）使用碘伏消毒会阴部和尿道外口，采用导尿术采集不少于40 mL尿液至50 mL无酶无DNA离心管中，以防止外源性污染，将尿液放在置有冰袋的泡沫盒内于半小时内送至实验室；2）将尿液放在高速低温离心机内离心1小时，于15000×g条件下离心，温度为4℃；3）用5 mL移液枪及灭过菌的无菌枪头吸去大部分上清液，仅留下沉淀物及底部1.5 mL的上清液，利用移液枪将余留的上清液和沉淀物吹打混匀，并移至1.5 mL无菌离心管中；4）将上述1.5 mL离心管置于高速离心机内，于20000×g条件下离心1小时，温度为4℃；5）移去上清液，保留沉淀物，将250 µL细菌细胞裂解液加在沉淀物中，吹打混匀，直至无可见团块状物质为止；6）将上一步样本置于60℃水浴箱中，水浴30分钟，然后移于液氮中，保持30分钟，此步骤循环不少于6次；7）取上一步样本120 µL至PCR管，再加磁珠提取液60 µL，反复吹打混匀，掌上离心机离心30秒后将PCR管放置在磁力架上保持10分钟，吸去上清液，保留磁珠，掌上离心机离心30秒，再次吸去上清液；8）在PCR管中加入磁珠洗脱液反复洗脱磁珠2次，吸去磁珠洗脱液，此步骤在磁力架上进行，掌上离心机离心30秒，再将PCR管置于磁力架上，吸去洗脱液；9）加30 µL无菌去离子水至PCR管中，反复吹打混匀，直至无可见磁珠，此步骤不可在磁力架上进行；10）将上一步样本置于磁力架上，静置10分钟，吸去上清液，即DNA；11）对细菌16S rRNA基因V3‑V4区域进行PCR扩增并对产物进行DNA电泳检测。