[发明专利]一种新型5种抗菌肽串联表达重组工程菌构建方法及其应用

摘要

本发明公开了一种新型5种抗菌肽串联表达重组工程菌构建方法及其应用，通过将5种不同的广谱抗菌肽串联，中间插入甲酸切割位点，构建到酵母分泌性表达载体pPIC9k中，并经酶切线性化后转化毕赤酵母感受态细胞获得。重组工程菌插入氨基酸序列特点，所有氨基酸用毕赤酵母偏好性密码子进行替换，以保证在毕赤酵母中的最优表达。插入序列为5种不同的广谱抗菌肽串联表达，中间插入甲酸切割位点。本发明根据毕赤酵母的密码子偏爱性对5种新型抗菌肽进行优化并串连，然后构建真核重组表达载体，达到5种不同抗菌肽在毕赤酵母中的串联表达，提高发酵产物的表达量及活性。

主权项

1.一种新型5种抗菌肽串联表达重组工程菌构建方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1.串联表达抗菌肽基因序列设计通过文献查阅法筛选到5个广谱高效低毒的抗菌肽，抗菌肽数据库编号分别为AP02901，AP02785，AP02847，AP02786，AP02898；根据抗菌肽的氨基酸序列，利用毕赤酵母偏爱性密码优化其核苷酸序列，不同抗菌肽之间以甲酸切割位点分割，5个抗菌肽进行序列串联，最后首尾两端分别加入酶切位点，串联表达设计顺序为EcoR I+ATG+kex2+抗菌肽AP02901+甲酸切割位点+抗菌肽AP02785+甲酸切割位点+抗菌肽AP02847+甲酸切割位点+抗菌肽AP02786+甲酸切割位点+抗菌肽AP02898+甲酸切割位点+终止子+Not I，具体序列如SEQ：ID：NO:1所示；翻译的蛋白序列如SEQ：ID：NO:2所示，委托武汉金开瑞生物科技公司进行基因合成；5个抗菌肽单体氨基酸序列分别为：AP02901如SEQ：ID：NO:3所示；AP02785如SEQ：ID：NO:4所示；AP02847如SEQ：ID：NO:5所示；AP02786如SEQ：ID：NO:6所示；AP02898如SEQ：ID：NO:7所示；步骤2.载体构建利用限制性酶切将串联表达框通过酶切位点EcoR I和Not I与毕赤酵母表达载体pPIC9K相连，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，氨苄抗性筛选，结合菌落PCR及测序鉴定重组表达载体；步骤3.酵母转化线性化重组质粒电击法转化进毕赤酵母GS115感受态细胞中，涂布MD平板筛选，30℃培养2‑3天；步骤4.转化子筛选鉴定将MD平板上的转化子转接到G418平板上筛选多拷贝子，筛选浓度3mg/ml；挑取筛选后的多拷贝子，通过提取转化子的基因组进行PCR反应，筛选阳性菌；得到表达串联重组抗菌肽的基因工程菌；步骤5.串联重组抗菌肽的诱导表达及高效表达工程菌的筛选挑选将经过G418筛选及PCR鉴定的重组菌20个，分别用1‑20号进行编号；于25mL BMGY液体培养基中，30℃、220r/min培养18h；将培养液置于预先灭菌的离心管中，6000rpm离心10min，收集沉淀，后转接到100ml BMMY液体培养基中，每24h加一次甲醇，甲醇终浓度为1％，分别在24、48、72、96、120h取样，12000r/min离心2min，取上清液，发酵上清液用考马斯亮蓝法测定蛋白含量，并用Tricine‑SDSPAGE凝胶电泳检测表达蛋白，并通过灰度分析，检测纯化后的串联重组抗菌肽含量，筛选出高效表达工程菌菌株。