[发明专利]一种基于根尖的尖叶牛樟染色体核型的分析方法

摘要

本发明公开了一种基于根尖的尖叶牛樟染色体核型分析方法，包括以下步骤：在晴朗的上午采集牛樟组培苗健壮、白嫩的根尖为试验材料，预处理，固定与保存，采用酶解去壁低渗法，经固定、前低渗、酶解、后低渗、涂片获得较佳的染色体标本，其中酶解采用4％纤维素酶和5％果胶酶混合物酶解，吉姆萨染色，镜检；该方法简单易操作，适用于原位PCR、FISH操作的尖叶牛樟染色体核型分析方法，为牛樟细胞学研究提供技术基础。本发明首次报道了尖叶牛樟的染色体核型分析方法和核型，表明牛樟有24条染色体，核型公式为2n＝2x＝24＝22m+2sm，核型不对称系数55.81％，属于2B类型，属于较原始物种。为尖叶牛樟的起源，演化及遗传育种提供一定理论依据。

主权项

1.一种基于根尖的尖叶牛樟染色体核型分析方法，其特征在于：所述的分析方法具体步骤如下：S1:取材在晴朗的上午采集牛樟组培苗健壮、白嫩的根尖；S2：预处理把刚采集的根尖进行预处理；S3:固定与保存倒掉预处理液，清水冲洗后转入卡诺固定液，在黑暗4℃环境下固定24h，移弃固定液，直接用来染色体制片；S4:染色体标本制备(1)前低渗:把S3固定的根尖置于蒸馏水中进行前低渗30min；(2)酶解:把步骤(1)的根尖置于盛有5％纤维素酶和4％果胶酶混合液的1ml离心管中，并置于37℃的恒温水浴锅中酶解3‑5h；(3)后低渗:吸取酶液，缓缓地沿着管壁加入蒸馏水，后低渗30min；(4)后固定:吸取蒸馏水，滴加临时配制的固定液，后固定15min；(5)涂片：把玻片、临时配制的固定液均置于冰面上，取一张玻片，先滴固定液，再夹取根尖置于玻片上，用解剖针挑取白色的根尖分生组织，并迅速捣碎再均匀涂抹在载玻片上，再从一端滴加固定液使细胞扩散，接着在火焰上迅速烘烤，自然风干。S5:染色将缓冲液甲液、乙液与吉姆萨原液按比例配制成工作液，再把干燥的制片置于吉姆萨染色液中染色10‑20min，清水冲洗干净，置烘箱37℃烘干；S6:镜检用POTIKA正立显微镜观察，Optika Vision pro拍照系统拍照，在40X物镜下对单位视野面积内处于分裂中期的细胞进行计数，选择30个染色体分散且形态较好的细胞进行染色体数目统计，选取5个染色体形态清晰且无重叠的细胞用Photoshop图像软件进行核型分析。