[发明专利]一种基于代谢组学分析鉴别松花粉储藏时间的方法

摘要

本发明公开了一种基于代谢组学分析鉴别松花粉储藏时间的方法，包括包括制备松花粉提取液，对提取液进行色谱检测和质谱检测，对检测数据分析处理确定松花粉标志性代谢产物以及对松花粉标志性代谢产物进行二级质谱检测。本发明的有益效果是：本发明通过乙醇提取松花粉代谢物进行UPLC‑QE‑MS分析，UPLC‑QE‑MS数据使用Compound Discover处理，再将数据导入SIMCA14.0软件，使用主成分分析(PCA)、偏最小二乘判别分析(PLS‑DA)和正交‑偏最小二乘判别分析(OPLS‑DA)进行多元统计分析，能够快速准确地寻找出不同储藏时间松花粉的代谢产物，从而用于不同储藏时间松花粉的区分鉴别。

主权项

1.一种基于代谢组学分析鉴别松花粉储藏时间的方法，其特征在于，包括如下步骤：/n1)制备松花粉提取液/n将松花粉与乙醇涡旋混合，经超声提取后置入离心机中离心，将上清液经过孔径为0.22μm的滤膜过滤，即得松花粉提取液；/n2)色谱检测/n将步骤1)所得松花粉提取液进行UPLC-QE-MS上样分析检测，色谱柱为ACQUITY UPLCBEH C18柱(2.1×50mm，1.7μm)，柱温25℃，进样流速为0.2μL/min，进样体积为2μL，色谱检测参数为：/n正谱条件：洗脱液A相为含0.15％(v:v)甲酸的10Mm醋酸铵水溶液，B相为0.1％(v:v)甲酸乙醇溶液，梯度洗脱流程为：0-2.5min 97％A，2.5-3min 97％-91％A，3-4min 91％-80％A，4-5.5min 80％-75％A，5.5-6.5min 75％-65％A，6.5-8.0min 65％-55％A，8.0-8.65min55％-30％，8.65-9.75min 30％-20％A，9.75-11.75min 20％-15％A，11.75-15min 15％-1％A，15-16.5min 1％A，16.5-17.5min 1％-90％A，17.5-20min 95％A；/n负谱条件：洗脱液A相为8Mm醋酸铵水溶液，B相为甲醇，梯度洗脱流程为：0-2.5min96％A，2.5-3.5min 96％-75％A，3.5-4.5min 75％-50％A，4.5-5.5min 50％-20％A，5.5-6.5min 20％-8％A，6.5-10min 8％-1％A，10-12min 1％A，12-14min 1％-95％A，14-16min95％A；/n3)质谱检测/n将步骤1)所得松花粉提取液进行质谱检测，质谱检测条件为：/n一级质谱/n正谱条件：分辨率，60000(FWHM)；鞘气，35Arb；辅助气，20Arb；反吹气，0Arb；喷雾电压，3.6kV；毛细管温度，310℃；辅助气温度，320℃。扫描范围，m/z：85-1050。扫描模式：FullMs；/n负谱条件：分辨率，60000(FWHM)；鞘气，35Arb；辅助气，20Arb；反吹气，0Arb；喷雾电压，3.0kV；毛细管温度，310℃；辅助气温度，320℃，扫描范围，m/z：85-1050，扫描模式：FullMs；/n二级质谱/n正谱条件：分辨率，180000(FWHM)；鞘气，30Arb；辅助气，10Arb；反吹气，0Arb；喷雾电压，3.6kV；毛细管温度，310℃；辅助气温度，320℃；扫描范围，m/z：85-1050，HCD高能碰撞池碰撞能量NCE:30、60、80、100，扫描模式：Full MS-ddMS2；/n负谱条件：分辨率，180000(FWHM)；鞘气，30Arb；辅助气，10Arb；反吹气，0Arb；喷雾电压，3.0kV；毛细管温度，310℃；辅助气温度，320℃；扫描范围，m/z：85-1050。HCD高能碰撞池碰撞能量NCE:30、60、80、100，扫描模式：Full MS-ddMS2；/n4)Compound Discover数据处理/n使用Compound Discover软件对步骤2)和步骤3)所得检测数据进行提取、分析、整理，通过峰对齐、去卷积、降噪、归一化处理，得到原始数据矩阵；/n5)SIMCA软件数据处理/n将步骤4)的原始数据矩阵导入SIMCA14.0进行分析，使用主成分分析PCA、偏最小二乘判别PLS-DA和正交-偏最小二乘判别OPLS-DA分析数据，运用置换排列实验检验，结合原始数据矩阵中的物质在两种松花粉中峰面积比值Ratio和P值，Ratio值大于10或小于0.5且P值小于0.01的代谢物即认定为松花粉标志性代谢产物；/n6)松花粉标志性代谢产物的二级质谱检测/n将步骤5)的松花粉标志性代谢产物进行二级质谱分析，得到二级质谱信息，二级质谱保留时间与一级质谱保留时间的允许偏差为0.1min，保留时间对应的物质即为不同储藏时间松花粉的标志性代谢产物。/n