[发明专利]用于人体细胞重编程的重组仙台病毒的制备方法及其应用

摘要

本发明提供了一种用于人体细胞重编程的重组仙台病毒的制备方法，包括：制备含有T7终止子、P基因、L基因、NP基因和IRES片段的三种辅助质粒，和含有T7启动子、锤头状酶序列、乙肝核酶序列、T7终止子的pUC57‑Simple质粒；将所述pUC57‑Simple质粒酶切后连接full‑2质粒酶切产物，得到仙台病毒主骨架质粒；提供BSR‑T7/5细胞，使用DMEM无血清完全培养基培养；转染前换液为Opti‑MEM培养基，并加入所述病毒辅助质粒T7‑IRES‑P/L/NP和所述仙台病毒主骨架质粒；在lipo3000中添加聚乙烯亚胺作为转染试剂进行转染；将转染后的细胞体进行增殖培养，收集重组仙台病毒。

主权项

1.一种用于人体细胞重编程的重组仙台病毒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：提供pBluescript II SK(+)质粒和T7终止子，采用infusion融合技术制备pBluescript II SK(+)T7 terminator质粒；将所述pBluescript II SK(+)T7 terminator质粒采用Kpn1和Not1酶切处理后，分别插入P基因、L基因和NP基因，获得T7‑P/L/NP质粒；将所述T7‑P/L/NP质粒采用Kpn1酶切成线性质粒后，与IRES片段进行融合，制备病毒辅助质粒T7‑IRES‑P/L/NP；在pUC57质粒中插入T7终止子、T7启动子、锤头状酶序列、乙肝核酶序列，制备pUC57‑Simple质粒；将所述pUC57‑Simple质粒采用Kpn1、Not1酶切，同时连接经Kpn1、Not1酶切后的full‑2质粒酶切产物，制备得到pUC57‑Sev，将所述pUC57‑Sev与目的基因连接，得到仙台病毒主骨架质粒；提供BSR‑T7/5细胞，接种、培养；转染前将培养基换液为Opti‑MEM培养基，然后加入所述病毒辅助质粒T7‑IRES‑P/L/NP和所述仙台病毒主骨架质粒继续培养；在lipo3000中添加聚乙烯亚胺作为转染试剂，按照lipo3000说明书进行转染；将转染后的细胞体系置于病毒增殖培养基中进行增殖培养，经沉淀处理收集重组仙台病毒，其中，所述病毒增殖培养基含有TPCK处理胰酶或重组人肺β类胰蛋白酶、以及谷氨酰胺。