[发明专利]一种基于原位信号放大的夹心型前列腺特异性抗原光电化学检测方法

摘要

本发明公开一种基于原位信号放大的夹心型前列腺特异性抗原光电化学检测方法。该方法将Au NCs作为基底材料，因其良好的导电性促进光生电子的转移，利用巯基苯硼酸的巯基与金锥成键，硼酸键与抗体的氨基形成环状成键，使前列腺特异性抗原抗体(Ab1)固定到电极界面。壳聚糖(CS)具有模拟酶的效果，将TiO2‑B@CS‑Ag+复合物与二抗(Ab2)结合，形成光电化学探针。通过发生免疫反应，在模拟酶的作用下原位生成Ag2S；由于Ag2S能增敏TiO2‑B的光电信号，随着抗原浓度的增加，标记物浓度增加，光电信号不断增强。本发明方法可实现对前列腺特异性抗原浓度在1×10‑6 ng/mL–50 ng/mL范围内的检测。

主权项

1.一种基于原位信号放大的夹心型前列腺特异性抗原光电化学检测方法，其特征在于，包括以下步骤：（1） 玻碳电极（GCE）的预处理：GCE首先在铺有氧化铝粉末的麂皮上机械打磨抛光，用二次水洗去表面残留粉末，再移入超声水浴中清洗，直至清洗干净，最后依序用乙醇，稀酸和水彻底洗涤；（2） Au/Ab₁/PSA修饰电极的制备：滴加3 μL金锥(Au NCs)溶液于干净的玻碳电极表面，红外灯下烘干，冷却至室温，然后将3 μL巯基苯硼酸溶液滴涂到修饰过的电极表面，在4 °C下孵育50 min，用二次水清洗，去除多余的溶液，将修饰电极于5 μL浓度为1 mg/mL 的前列腺特异性抗原的抗体Ab₁溶液中4 °C下孵育50 min，随后使用pH 7.4的磷酸缓冲溶液去除多余的前列腺特异性抗原的抗体Ab₁，再将电极浸入20 μL 浓度为1.0 wt.%的牛血清白蛋白（BSA）溶液1 h，封闭电极表面上非特异性活性位点，用pH 7.4的磷酸缓冲溶液冲去表面残余液后，即得到Au/Ab₁修饰电极，将电极浸入5 μL不同浓度的前列腺癌细胞抗原（PSA）标准溶液中于4°C下孵育50 min，用pH 7.4的磷酸缓冲溶液冲洗电极表面并在室温条件下自然晾干，得到Au/Ab₁/PSA修饰电极；（3） Au/Ab₁/PSA/Ab₂/Ag₂S修饰电极的制备：称取一定量的TiO₂‑B固体粉末，用二次水分散均匀，配制成浓度为3 mg/mL的悬浮液，将TiO₂‑B溶液与壳聚糖溶液按照体积比为1:2的比例进行混合，摇匀30 min，反应好的溶液在转速为5000 rpm的转速下离心10min，去除多余的壳聚糖溶液，再加入一定量的二次水分散，形成TiO₂‑B@CS溶液；按照AgNO₃溶液与TiO₂‑B@CS体积比为1:1的比例，将一定浓度的AgNO₃溶液加入到TiO₂‑B@CS溶液中，摇匀反应30min，使Ag⁺充分吸附到TiO₂‑B表面，通过离心，去除多余的Ag⁺，再将固体用二次水分散均匀形成处理过的TiO₂‑B溶液；按照体积比为1:3的比例将前列腺特异性抗原二抗(Ab₂)与处理过的TiO₂‑B溶液混合，在4°C下反应2h，离心去除未吸附的二抗，用pH为7.4的磷酸缓冲溶液分散，再加入一定量的BSA溶液封闭非活性位点，得到Ab₂‑TiO₂‑B@CS‑Ag⁺溶液，放置冰箱待用；用移液枪吸取一定量的Ab₂‑TiO₂‑B@CS‑Ag⁺溶液，滴涂到Au/Ab₁/PSA修饰电极上，在4 °C下孵育1 h，用二次水清洗，除去多余的物理吸附，得到Au/Ab₁/PSA/Ab₂电极；在室温下，将0.26 M的H₂O₂与0.2 M的AgNO₃溶液一起滴涂到修饰的Au/Ab₁/PSA/Ab₂电极表面，反应15 min，在H₂O₂与TiO₂‑B@CS的催化作用下，原位生成Ag₂S，得到Au/Ab₁/PSA/Ab₂/Ag₂S电极；（4） 前列腺特异性抗原的检测：采用三电极体系进行测定，以Au/Ab₁/PSA/Ab₂/Ag₂S修饰电极为工作电极，Ag/AgCl为参比电极，铂丝电极为对电极，利用光电化学工作站进行检测，设置电压为‑0.1 V，每隔10 s进行开关灯，氙灯发射的单色光激发光源使用前由单色仪过滤；在pH 7.4的 PBS缓冲溶液中，通过光电化学工作站进行检测1×10^‑6 ng/mL‑50 ng/mL一系列不同浓度的前列腺特异性抗原标准溶液，通过记录开关灯前后产生的不同电流信号，绘制工作曲线；待测样品溶液代替前列腺特异性抗原标准溶液进行检测，检测的结果可通过工作曲线查得。