[发明专利]一种H9N2亚型禽流感病毒疫苗候选株rHANA3的构建方法

摘要

一种H9N2亚型禽流感病毒疫苗候选株rHANA3的构建方法，属于禽流感疫苗研制技术领域，通过红细胞解凝试验从本实验室分离、保存的毒株中筛出三株解凝速度不同的H9N2亚型禽流感病毒，构建其NA片段的真核表达质粒，并以毒株构建HA片段表达质粒，运用8质粒拯救系统，以H1N1的内部基因为骨架，获得NA片段不同的疫苗候选株病毒，免疫鸡制备血清，挑选出血清交叉中和能力好的毒株作为疫苗候选株，本发明构建方法科学，原理清晰，通过该方法制备的疫苗抗血清可提高对Y280‑Like和F98‑Like病毒的交叉反应性以及中和效价，克服现有疫苗只能保护单一抗原型及交叉保护差的问题，大大节约了成本，为流感防控提供更为有效的工具，为研制广谱型疫苗提供了一种新方法。

主权项

1.H9N2亚型禽流感病毒疫苗候选株rHANA3的构建方法，其特征在于，所述构建方法如下：(1)解凝试验筛选不同解凝速度的H9N2亚型毒株分离鉴定保存H9N2 AIV：W2‑17、SN、QD5、FY2014040、WJ100和YZ4作为候选株，将候选H9N2亚型禽流感病毒经2倍梯度稀释后，再加等量的1%鸡红细胞，4℃作用30min后转移至37℃中，每隔一小时记录每个病毒株的HA效价，绘制解凝曲线，分析病毒解凝速度，筛选毒株；(2)血凝试验筛选HA片段对候选毒株进行血凝试验，测定各候选H9N2亚型AIV的HA效价，选取其中血凝效价最高的病毒，构建其HA基因表达质粒；(3)HA及NA片段表达质粒的构建方法如下：(3‑1)引物设计参照Hoffmann对流感病毒的8个片段设计的通用引物，设计HA及NA片段全长扩增引物；(3‑2)病毒RNA的提取及cDNA反转录根据Trizol Reagent试剂说明提取病毒RNA；将病毒尿囊液8000 rpm 离心10 min取250 µL加入RNase‑free的离心管中；加入500 µL Trizol Reagent，充分混匀后，放置5 min；加入200 µL三氯甲烷，剧烈混匀后，13000 rpm离心10 min；将上步中离心上清液450 µL加入新的离心管中，再加入900 µL异丙醇，混匀后放入‑20℃作用5 min后13000 rpm离心10 min；弃上清，加入1 mL 75% DEPC水处理的乙醇，轻轻混匀，放入‑20℃作用5 min后13000 rpm离心10 min，弃上清；根据HiScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit反转录试剂盒说明书进行病毒cDNA的反转录；反转录好的cDNA，于‑20℃保存备用；(3‑3)目的片段的扩增及纯化(3‑3‑1)使用Phanta Max Super‑Fidelity DNA Polymerase，以病毒cDNA 为模板，扩增HA及NA基因片段，25µL PCR体系如下：10×PCR buffer/12.5 μL、dNTP(10 Mm)/0.5 μL、上游引物(25 µmol/µL)/0.5 μL、下游引物(25 µmol/µL)/0.5 μL、高保真酶/0.5 μL、DNA模板/2 μL、ddH2O/8.5 μL；(3‑3‑2)反应程序：预变性温度为95℃3min；然后以95℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸1.5 min，进行35个循环，最后72℃延伸10min；(3‑3‑3)将PCR产物通过1%琼脂糖凝胶水平电泳进行鉴定，以核酸MarkerGeneRuler 1 kb DNA Ladder为标准参照，染色后观察结果，成功扩增出了SN株HA基因片段，命名为SN‑HA，以及三株病毒的NA基因片段，分别命名为NA1、NA2和NA3；(3‑3‑4)将PCR产物条带切下后，按照使用用凝胶纯化回收试剂盒说明进行目的片段的纯化，测定纯化产物的浓度和纯度；(3‑4)目的片段与T载体的连接参照pEASY‑Blunt3 Cloning Kit和Trans1‑T1感受态细胞使用说明，将其克隆至T载体，连接产物转化Trans1‑T1感受态细胞，挑斑小提质粒，经EcoR I酶切鉴定阳性的质粒送金斯瑞生物工程有限公司测序验证，测序正确的质粒‑20℃保存备用；(3‑5)HA、NA片段及真核表达载体的酶切与连接将鉴定为阳性克隆的HA及NA质粒测定浓度后，分别用BsmBⅠ、Bsa I限制性内切酶进行酶切，将pHW2000载体用BsmBⅠ 酶切，酶切后产物进行琼脂糖凝胶电泳，把相应大小条带的胶块切下并胶回收，用T4连接酶将酶切后的pHW2000载体和目的产物连接，连接产物转化感受态细胞Trans1‑T，于37℃培养箱培养12‑14 h，挑取单个菌落于15 mL氨苄LB液体培养基中培养过夜，菌落PCR鉴定，将大小正确的菌液进行测序，测序结果正确后，用QIAGEN试剂盒提取质粒，测定其浓度和纯度，选取浓度在300 ng/μL以上，OD260/OD280在1.8‑2.0之间的质粒保存备用；(4)病毒拯救(4‑1)将构建好的HA片段表达质粒pHW‑SN‑HA分别与构建好的不同解凝速度病毒的NA片段表达质粒pHW‑NA1、pHW‑NA2以及pHW‑NA3组合，以PR8其余6个片段为骨架进行转染，同时转染pHW‑SN‑HA与PR8其他7个片段组合的重组病毒作为对照；(4‑2)用含10%胎牛血清的DMEM细胞培养基提前复苏并扩大培养293T细胞和MDCK细胞，在转染前一天，将293T细胞及MDCK细胞以3:1的比例混匀铺于35 mm的细胞培养皿，培养至细胞汇合度70%‑80%时，可以进行转染，转染之前1 h将细胞培养液换成1 mL的无抗无血DMEM培养基；转染用每片段质粒量应为300 ng，转染质粒总用量为2.4 μg；取4只无菌1.5 mL指形管，分别加入50 μL无抗无血DMEM，再将质粒按照重组方案分别加入4个离心管中，用微量移液器轻轻吹匀；另取4只无菌指形管，分别加入50 μL无抗无血DMEM和3 μL PolyJet^TM转染试剂，轻轻混匀；混匀后立即分别加入上述质粒溶液中，轻轻吹吸混匀，室温孵育10‑15 min以形成PolyJet^TM–DNA 复合物，孵育结束后将混合液逐滴加入培养皿中，边加边轻微晃动以混匀；然后移入CO2细胞培养箱中静置培养；转染8‑12 h后，加入终浓度为2 μg/mL的TPCK胰酶；转染后72 h将培养皿置于‑70℃反复冻融三次，收取细胞上清，接种10日龄的SPF鸡胚，0.2 mL/胚，检测重组病毒拯救是否成功；每12 h照胚一次，弃去24 h内死亡的鸡胚；培养72 h后收取鸡胚的尿囊液，并用血凝试验测定HA效价，收取有HA效价的澄清尿囊液；(4‑3)将收获的尿囊液提取RNA进行反转录并PCR，测序鉴定各序列是否正确；将血凝阳性且鉴定正确的病毒尿囊液用四抗PBS稀释10000倍，用10日龄SPF鸡胚传至第5代，测定各代次尿囊液的血凝效价，检测重组转染病毒是否能在鸡胚中稳定传代；将第5代病毒尿囊液提取RNA并反转录进行序列测定，鉴定是否发生突变，序列完全正确后进行后续试验；(5)候选株病毒血清交叉反应性(5‑1)病毒灭活及血清制备(5‑1‑1)取重组病毒及母本病毒SN株尿囊液，以8000 r/min离心10 min后取上清测定病毒灭活前HA效价，病毒尿囊液与稀释好的1:50甲醛溶液以43:7的比例混合均匀至4℃摇床放置，震摇灭活24 h；取出灭活的病毒尿囊液，测定灭活后血凝效价，血凝效价>4 log₂时满足要求；(5‑1‑2)在灭活好的病毒尿囊液中以24:1比例加入吐温80，混匀后，以3:1比例将白油加入灭活病毒后乳化制备疫苗；用制成的疫苗颈部皮下注射3周龄SPF鸡，0.2 mL/只，每组注射5只SPF鸡；免疫后，测定血清HI效价≥7 log₂时可采集鸡血，若未达到则在一免后21d加强免疫一次，二免后测定血清HI效价≥ 7 log₂时采集鸡血，分离血清，冻存于‑70℃冰箱中备用；(5‑2)血清交叉血凝抑制试验(5‑2‑1)测定各病毒尿囊液HA效价，将病毒HA价调至2 log₂，在96孔血凝板中加入25 μL PBS，每行第1孔加入各个重组病毒的抗血清，并将各血清倍比稀释后，再加入配好的4单位病毒，37℃条件下作用15 min，作用后加入1%鸡红细胞，并转移到37℃条件下作用10 min后观察结果；(5‑2‑2)选取不同亚系不同年份的H9N2禽流感病毒分离株进行交叉血凝抑制试验；其中W2‑17、QD5、WJ100、TX和28‑1株属于Y280‑Like，WXQ 株为G1‑Like，YZ4 株为F98‑Like；(5‑3)血清中和试验(5‑3‑1)选取SN及YZ4毒株，测定EID₅₀；进行中和试验时，将病毒稀释成200个EID₅₀，使其与稀释好的血清等量混合后，每个接种剂量中含有100个EID₅₀；选取重组病毒及野生型SN抗血清，先将血清灭活处理（56℃处理30 min），随后将血清用四抗PBS从1:10开始进行2倍连续稀释；将定量好的两种病毒分别与等体积稀释好的各组血清混合均匀，并在37℃ 作用1 h，作用后迅速将混合物接种10日龄SPF鸡胚，每个混合物接种4个鸡胚；同时，将稀释为100个EID₅₀的病毒接种SPF鸡胚，作为阳性对照；接种后每日观察，4天后检测鸡胚感染情况，根据Reed‑Muench法计算血清中和效价；(5‑3‑2)中和试验结果显示，候选株rHANA3组血清对Y280‑Like病毒SN的中和效价高于rHANA1、rHANA2、rHANAPR8及野生型病毒SN组抗血清；对F98‑Like病毒YZ4的中和效价高于rHANA1、rHANA2及野生型病毒SN组抗血清。