[发明专利]一种牛睾丸支持细胞诱导多能干细胞的方法

摘要

本发明公开了一种牛睾丸支持细胞诱导多能干细胞的方法，属于干细胞领域，包括如下步骤：步骤1、分离牛睾丸支持细胞；步骤2、培养牛睾丸支持细胞；步骤3、将编码Oct4、Sox2、c‑Myc和Klf4四种转录因子转入牛睾丸支持细胞中，产生多能性干细胞。与现有技术相比，本发明充分利用了牛睾丸支持细胞差异贴壁的特点，培养出了形态均一的牛睾丸支持细胞。由于牛睾丸支持细胞来自于肉用犊牛具有较高的重编程能力。以牛睾丸支持细胞代替牛成体成纤维细胞、间充质干细胞等作为来源细胞制备诱导多能干细胞，不仅细胞获取简便而且重编程率高。

主权项

1.一种牛睾丸支持细胞诱导多能干细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1、分离牛睾丸支持细胞：将从屠宰场取回的肉用牛睾丸，在无菌条件下充分分解后加5倍体积DMEM培养基并吹打，吹散成单个曲细精管，静置5min后弃上清，重复5次以去除睾丸间质细胞，至上层液体澄清后加5倍体积的含50μg/mL脱氧核糖核酸酶Ⅰ及1mg/mL胶原酶Ⅳ的消化液Ⅰ，32℃恒温摇床孵育60min，转速140rpm；用含10％胎牛血清的DMEM培养基离心洗涤去上清，随后加5倍体积含1mg/mL胰蛋白酶、1mg/mL透明质酸酶、50μg/mL脱氧核糖核酸酶Ⅰ、1mg/mL胶原酶IV的消化液Ⅱ，32℃恒温摇床孵育30min，用含有10％胎牛血清的DMEM培养基离心洗涤后加DMEM培养基重悬；用40μm细胞过滤网进行过滤，收集滤液并离心洗涤，弃上清后以1mL的DMEM培养基重悬，2h后，牛睾丸支持细胞进行差异贴壁，得到牛睾丸支持细胞；步骤2、培养牛睾丸支持细胞；步骤3、将编码Oct4、Sox2、c‑Myc和Klf4四种转录因子转入牛睾丸支持细胞中，产生多能性干细胞。