[发明专利]一种基于酶联免疫鉴别丝织品残片的方法

摘要

本发明涉及文物检测技术领域，公开了一种基于酶联免疫鉴别丝织品残片的方法，本发明先制备了桑蚕丝丝素蛋白和柞蚕丝丝素蛋白的单克隆抗体，然后利用固定化木瓜蛋白酶对抗体进行处理，得到具有较高活性的Fab片段抗体，并将该片段和金纳米粒子复合，得到具特异性的Fab‑Au NP复合物。经酶联免疫实验表明，该复合物能高效性地鉴别出古代丝织品残片的种类。本发明反应温和、环保无害；在对古代丝织品进行检测时，具有样品用量少、直观、快速和高灵敏性的特点。

主权项

1.一种基于酶联免疫鉴别丝织品残片的方法，其特征在于包括以下步骤：1）蚕丝特异性抗体的制备：称取桑蚕丝和柞蚕丝，经脱胶、溶解、透析、纯化和冷冻干燥后，分别得到桑蚕丝丝素蛋白粉末和柞蚕丝丝素蛋白粉末；将两种丝素蛋白粉末分别溶解在PBS中注射进SPF级Balb/C纯种雌性小鼠体内，经多次脾脏免疫后，将脾细胞与骨髓瘤细胞融合，经克隆、筛选、培养和纯化后，分别得到桑蚕丝丝素蛋白单克隆抗体和柞蚕丝丝素蛋白单克隆抗体；2）Fab片段抗体的制备：先在分离柱中对固定化木瓜蛋白酶进行活化，同时将步骤1）中所得两种抗体分别在buffer交换柱中进行前处理，得到两种抗体溶液；将两种抗体溶液分别加入到活化的固定化木瓜蛋白酶中，拧紧柱子盖子，置于35‑39℃恒温震荡孵化箱中酶解反应，采用亲和层析法纯化和凝胶过滤层析柱对酶解产物进行分离纯化后，得到桑蚕丝丝素蛋白Fab片段抗体和柞蚕丝丝素蛋白Fab片段抗体；3）Fab‑Au NP复合物的制备：将步骤2）所得两种Fab片段抗体进行硫醇化处理后，分别取50‑80 μL加入到Au NP溶液中，于35‑39℃恒温震荡孵化箱中反应40‑50min，11000‑14000rpm 离心10‑20min后，重新分散在PBST中，得到Fab‑BM‑Au NP复合物和Fab‑AP‑Au NP复合物；4）包被抗原的制备：按固液比0.8‑1.2g/100mL将丝织品残片溶于钙醇溶液中，在96‑100℃下加热1.5‑2 h，得到蚕丝蛋白溶液；取部分蚕丝蛋白溶液，加入Na2CO3/NaHCO3缓冲液，并于6000‑10000rpm离心5‑15min，取上清液作为抗原包被液，抗原包被液浓度为1mg/mL；5）抗原包被和封闭：将抗原包被液加入96孔板中，每组5个孔，每孔100 μL，加入两组形成实验组1、2，实验组1后续加入Fab‑BM‑Au NP 复合物，实验组2后续加入Fab‑AP‑Au NP复合物，并设立只加入Na2CO3/NaHCO3缓冲液的阴性对照组、用BSA代替Fab‑Au NP复合物的空白对照组和含有丝素蛋白溶液的阳性对照组，于1‑5℃过夜包被，弃去包被液，洗涤；加入0.8‑1.2wt% BSA，于35‑39 ℃ 孵育1‑3 h，封闭掉多余的结合位点后，弃去封闭液，洗涤；6）免疫结合：将步骤3）中所得Fab‑BM‑Au NP复合物和Fab‑AP‑Au NP复合物稀释为Fab‑BM‑Au NP复合物溶液和Fab‑AP‑Au NP复合物溶液，实验组1每孔加入100 μL Fab‑BM‑Au NP复合物溶液，实验组2每孔加入100 μL Fab‑AP‑Au NP复合物溶液，空白对照组加入等量PBST，于35‑39℃孵育0.5‑1.5 h，弃去后洗涤；每孔加入100 μL过氧化辣根酶标记的二抗，于35‑39℃孵育0.5‑1.5 h，弃去后洗涤；7）TMB显色：向孔板中分别加入50 μL A液和B液，置于黑暗环境下反应8‑12 min，每孔加入100 μL 2mol/L H2SO4终止反应；8）吸光度测量；将孔板置于酶标仪中，读取450 nm处的吸光度数值，将孔板的阴性对照组OD均值加上 3×标准偏差作为该次实验的cut‑off值：若实验组1的OD均值>阴性对照组的cut‑off值，则丝织品残片为桑蚕丝；若实验组2的OD均值>阴性对照组的cut‑off值，则丝织品残片为柞蚕丝。