[发明专利]一种根癌农杆菌介导的多主棒孢遗传转化方法

摘要

本发明提供了一种根癌农杆菌介导的多主棒孢遗传转化方法，包括如下步骤：（1）多主棒孢对潮霉素的敏感性测定；（2）抗生素抑制农杆菌正常生长的浓度筛选；（3）多主棒孢分生孢子悬浮液制备；（4）含双元载体根癌农杆菌菌液制备；（5）根癌农杆菌与多主棒孢分生孢子共培养；（6）转化子的筛选；（7）转化子的分子鉴定，插入拷贝数以及遗传稳定性分析。本发明不需要去除真菌细胞壁制备原生质体，操作简单，转化效率高，并且得到的转化子单拷贝比例大，能够稳定遗传。本发明提供了一套稳定高效的根癌农杆菌介导的多主棒孢遗传转化方法，为获得致病突变体提供潜在可能，为深入研究致病相关基因及致病机制奠定基础。

主权项

1.一种根癌农杆菌介导的多主棒孢遗传转化方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）多主棒孢对潮霉素的敏感性测定：在含不同浓度潮霉素的PDA平板上接种多主棒孢，培养观察菌落生长情况，确定潮霉素最佳使用浓度；（2）抗生素抑制根癌农杆菌正常生长的浓度筛选：挑取农杆菌单克隆活化扩大培养后，收集菌体稀释均匀涂布于含不同浓度头孢霉素和特美汀的平板上，培养观察，确定抗生素最佳使用浓度；（3）多主棒孢分生孢子悬浮液制备：在培养好的平板菌落上加5mL IM液体培养基洗脱平板上的多主棒孢分生孢子，再用灭菌的毛笔扫落孢子，然后三层擦镜纸过滤获得孢子悬浮液，调节孢子浓度为1×105‑6 个/ mL；（4）含双元载体根癌农杆菌菌液制备：将含有双元载体的农杆菌划线接种于含有50μg/mL卡那霉素和25μg/mL利福平的固体LB平板上，黑暗培养2d，挑取单菌落到5mL含50μg/mL Kan和25μg/mL Rif的LB液体培养基，振荡培养过夜，取1.5mL菌液，离心去上清，用IM培养基清洗2次，再用1mL IM悬浮菌体，取少量菌液于5mL含AS的IM液体培养基，振荡培养5～6h使得OD600达到0.5～0.6；（5）根癌农杆菌与多主棒孢共培养：将孔径为0.45μm，大小为4cm×5cm的无菌硝酸纤维素膜平铺到含AS的CM培养基上；将准备好的农杆菌和孢子悬浮液等体积混合均匀，取200μL混合液均匀涂布在硝酸纤维素膜上，22‑25℃黑暗培养不少于48h；（6）转化子的筛选：根癌农杆菌与多主棒孢分生孢子共培养后将CM平板上的硝酸纤维素膜剪成细条状，并翻转平铺到筛选平板上，25℃黑暗培养，直至菌落出现，能长出的菌落初步确定为转化子；将长出的单菌落分别转接到新的含选择压力的平板上培养至菌丝铺满平板，用于分子检测；（7）转化子的PCR鉴定，插入拷贝数以及遗传稳定性分析：将上述转化子进行潮霉素磷酸转移酶基因的PCR验证，确定这些假定的转化子是不是真正的转化子，然后进行Southern blot 试验，分析其插入拷贝数，最后，检测这些转化子的遗传稳定性。