[发明专利]一种犬脂肪干细胞的提取方法及其制剂和应用

摘要

本发明采用犬异体脂肪干细胞制备治疗犬慢性肾病制剂，本发明的脂肪干细胞提取方法包括：获得犬腹腔脂肪组织、消化过滤离心、红细胞裂解液重悬、P0～P3代细胞培养。将得到的P3代的脂肪干细胞进行表面抗原检验，筛选出CD29、MHC‑I表达大于70％，且CD34、CD45表达小于2％，分化潜能高，能成脂、成骨、成软骨且染色体无异常，内毒素为阴性，支原体未检出的脂肪干细胞，以1×10⁶细胞/kg～5×10⁶细胞/kg的剂量，用0.5mL～1.0mL生理盐水重悬制备得到犬异体脂肪干细胞制剂，用于治疗犬慢性肾病。本发明的干细胞制剂免疫原性弱；不涉及社会、伦理、法律方面争论；无需接受移植者提供自体干细胞，几乎无损伤；分离方法简单，细胞活力很强，容易大量扩增。

主权项

1.一种犬脂肪干细胞的提取方法，其特征在于，所述包括以下步骤：步骤1：获得犬腹腔脂肪组织，去除包绕脂肪组织的非脂肪组织，用PBS冲洗处理后的脂肪组织并剪碎；步骤2：将步骤1获得的脂肪组织用0.1％胶原酶I型37℃震荡消化60～120min后，将消化好的脂肪组织放入冷冻离心机4℃，400～500RCF离心5～10min；步骤3：去除步骤2离心产物中的上层油脂及上清液，加入适量PBS混匀沉淀，经过100μm细胞筛网过滤，离心并去上清；步骤4：向步骤3所得离心沉淀加入红细胞裂解液重悬细胞，静置2～5min，加入PBS终止红细胞裂解液的作用，离心并去上清；加入适量DMEM+10％FBS培养液重悬后计数，按接种密度接种于培养瓶中；步骤5：P0代细胞培养：将上述培养瓶放置于二氧化碳培养箱培养，37℃、5％CO2及饱和湿度培养24h，使MSCs贴壁，更换培养液去除未贴壁细胞，之后每2～3天更换培养液；待细胞汇合率达70～90％，使用0.25％胰蛋白酶进行常规消化收获得到P0代细胞，用自设冻存程序冻存细胞，建立P0代主细胞库；步骤6：P1代细胞培养：将所述P0代细胞按照约5×103个/cm2密度接种于培养瓶中，放置于二氧化碳培养箱37℃、5％CO2培养不超过4天，每2～3天更换培养基；在此期间，在显微镜下观察细胞形态及生长状态，当细胞融合度达到70％～90％后，用胰酶消化收获得到P1代细胞；步骤7：P2代细胞培养：将所述P1代细胞按照约5×103个/cm2密度接种于培养瓶中，放置于二氧化碳培养箱培养，细胞培养至第2～4天，细胞融合度达到70％～90％，用消化酶消化收获得到P2代细胞；步骤8：P3代细胞培养：将所述P2代细胞接种于培养瓶中，放置于二氧化碳培养箱培养至细胞融合度达到70～90％后，用消化酶消化收获得到P3代细胞。