[发明专利]一种隐孢子虫蛋白激酶的纯化方法

摘要

本发明公开了一种隐孢子虫蛋白激酶的纯化方法，先通过构建隐孢子虫蛋白激酶的体外重组表达载体，再进行质粒转导、IPTG低温诱导表达，成功表达后的菌体裂解后，经割胶回收纯化蛋白；本发明纯化方法通过低温诱导以及改善IPTG浓度的方式，提高了表达蛋白的可溶性，同时通过割胶回收的方法解决了隐孢子虫蛋白激酶在体外表达中易出现的自切降解包涵体表达等问题，能够得到高纯度条带单一且具备酶学活性的重组蛋白，并且能够提高对难以表达、分子量较大蛋白的纯化效果。所纯化得到的蛋白能够进一步用于功能性分析研究，为解决隐孢子虫蛋白功能领域的诸多问题奠定基础。

主权项

1.一种隐孢子虫蛋白激酶的纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：S1.制备诱导表达蛋白S11.构建含隐孢子虫蛋白激酶基因的原核表达载体；S12.将S11的原核表达载体转入表达宿主菌，挑取阳性克隆菌，保存；S13.将S12挑取的阳性克隆菌经扩大培养至对数生长期后进行诱导表达；S14.取S13诱导表达后的菌液，冷冻离心收集菌体，弃上清，重悬菌体，然后冰浴超声裂解菌体；S15.取S14所得裂解液，冷冻离心分上清沉淀；对于可溶性蛋白，取上清直接进行后续实验；对于不可溶蛋白，将沉淀经尿素洗涤、溶解后，低温离心，取上清；S16.取步骤S15中所得上清溶液用0.45μm的滤膜进行过滤，然后与Ni柱在冰上孵育后，反复上柱若干次，然后经洗涤液充分洗涤后，用5倍柱体积的洗脱液收集目的蛋白；S2.割胶回收纯化蛋白S21.取S16所得蛋白溶液进行蛋白电泳，过程在冰上进行；电泳后蛋白胶经KCl溶液染色5～10 min；显影结束后根据蛋白Marker在目的蛋白大小处切下乳白色蛋白条带，经去离子水水洗浸泡至无色；S22.将S21中所得蛋白条带放入透析袋中，将透析袋浸润在缓冲液中，并进行电泳30～60 min，再调换电极，继续电泳2～3min；S23.将S22透析袋中所得蛋白溶液收集并放入新的透析袋中，更换浸润用缓冲液，再次透析，得到纯化后的隐孢子虫蛋白激酶。