[发明专利]一种制备带特定末端的双链DNA标准片段的方法在审
| 申请号： | 201811216035.3 | 申请日： | 2018-10-18 |
| 公开（公告）号： | CN109355280A | 公开（公告）日： | 2019-02-19 |
| 发明（设计）人： | 郑贤杰;朱垚;李剑辉;秦雪梅;曹振 | 申请（专利权）人： | 翌圣生物科技(上海)有限公司 |
| 主分类号： | C12N15/10 | 分类号： | C12N15/10 |
| 代理公司： | 上海精晟知识产权代理有限公司 31253 | 代理人： | 冯子玲 |
| 地址： | 200120 上海市浦*** | 国省代码： | 上海;31 |
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| 摘要： | 本发明提供一种制备带特定末端的双链DNA标准片段的方法，包括：步骤一、选取限制性内切酶：根据目的标准DNA的双端特性，筛选可产生相应末端的限制性内切酶，步骤二、筛选模板或构建模板：直接筛选模板：或者克隆构建模板：通过序列设计并合成带引物结合位点和酶切位点的短小片段；通过退火反应形成双端3’‑dT尾小片段双链；小片段通过连接反应构建到固定大小的PCR产物上；步骤三、通过特异性引物，经PCR扩增获得包含酶切位点和中间片段在内的DNA序列；步骤四、通过所筛选的限制性内切酶的酶切反应，切开两端酶切位点，获得特定双端的DNA片段；步骤五、纯化获得标准片段。本发明创造可以制备获得携带特定末端的DNA片段。 | ||
| 搜索关键词： | 限制性内切酶 酶切位点 构建 筛选 制备 双链DNA 双端 退火 引物结合位点 特异性引物 连接反应 酶切反应 序列设计 中间片段 标准DNA 小片段 双链 尾小 切开 合成 克隆 携带 | ||
【主权项】：
1.一种制备带特定末端的双链DNA标准片段的方法,其特征在于，包括：步骤一、选取限制性内切酶：根据目的标准DNA的双端特性，筛选可产生相应末端的限制性内切酶，步骤二、筛选模板或构建模板：a直接筛选模板：根据目的标准DNA片段的大小和两端酶切位点需求，在已知基因组或DNA模板上筛选出合适的目的区域；b克隆构建模板：通过序列设计并合成带引物结合位点和酶切位点的短小片段；通过退火反应形成双端3’‑dT尾小片段双链；将酶切位点小片段通过连接反应构建到固定大小的PCR产物上；步骤三、扩增获得模板：通过特异性引物，经PCR扩增获得包含酶切位点和中间片段在内的DNA序列；步骤四、酶切获得标准片段：通过所筛选的限制性内切酶的酶切反应，切开两端酶切位点，获得特定双端的DNA片段；步骤五、纯化获得标准片段。
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