[发明专利]一种全基因组分子标记检测的方法

摘要

本发明公开了一种全基因组分子标记检测的方法。本发明将传统的转座子显示技术与高通量测序技术相结合，简化了传统的转座子显示技术的实验流程，提高了实验结果的准确性。和传统的转座子显示技术不同，本发明利用Tn5转座酶复合体打断DNA，并在打断的DNA片段末端加上可以用来作为引物结合位点的DNA接头。本发明的方法操作简单，利用高通量测序技术替代聚丙烯酰胺凝胶电泳，不仅简化了实验流程，也提高了全基因组标记检测的准确性。结合高通量测序的barcoding技术，可以将不同样品的PCR扩增产物混合在一起进行测序，因此可以同时检测多个样本的分子标记信息，提高了分子标记检测的样本通量。

主权项

1.一种全基因组分子标记检测的方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）利用Tn5转座酶复合体随机打断水稻基因组DNA，同时，Tn5接头作为Tn5转座酶的反应底物，在Tn5切割DNA的同时被连接到断点处，作为后续PCR反应的引物结合位点；（2）Tn5转座酶复合体随机打断反应完成后将DNA产物，所有的DNA片段根据是否含有目标转座子分为两部分：不含目标转座子的片段和含有目标转座子的片段；第一轮PCR反应以T‑primer1与TD‑seq1为引物进行扩增；被扩增的片段都是含有目标转座子的DNA片段，而不含目标转座子的DNA片段由于没有T‑primer1引物结合位点，不会被扩增；经过第一轮PCR，包含目标转座子的DNA片段通过PCR扩增被富集，PCR产物的一端为目标转座子，此端被加上Illumina测序平台进行DNA测序时所需要的P5端的部分接头序列，另外一端是Illumina测序平台进行DNA测序时所需要的P7端的接头序列；（3）在第二轮PCR扩增时，以第一轮PCR产物为模板，利用引物T‑primer2和TD‑seq2，进行PCR扩增，通过第二轮PCR扩增，目的PCR产物片段的两端被加上Illumina测序平台进行DNA测序时所需要的P5和P7端的全部接头序列；（4）经过两轮PCR扩增，目标转座子附近的序列得到极大富集，对所富集的片段进行片段选择并进行高通量测序，得到的扩增片段中包含的SNP信息便反映基因组相应区域的DNA多态性。