[发明专利]检测鸡肉中恩诺沙星的银纳米粒子消光免疫层析试纸条

摘要

本发明属分析检测领域，公开了检测小分子物质的免疫层析试纸条：将修饰牛血清白蛋白的荧光物质分别与检测抗原以及抗免疫球蛋白G抗体混合，喷涂在试纸条特定区域上做为检测线及质控线，标记特异性单克隆抗体的银纳米粒子(银消光探针)喷涂在试纸条结合垫。当样品溶液不存在待测物时，银消光探针与检测线上检测抗原结合，吸收了荧光物质的激发光或发射光而使检测线无荧光，而质控线有荧光；当样品溶液存在待测物时，银消光探针优先与待测物结合，此时结合在检测线上的银消光探针数量减少，而结合在质控线上的银消光探针数量增加，导致试纸条检测线荧光增加，而质控线荧光下降。本发明较传统免疫层析试纸条检测小分子物质的消线判读模式更灵敏。

主权项

1.检测鸡肉中恩诺沙星的银纳米粒子消光免疫层析试纸条，其特征在于制备方法如下：待测物质为恩诺沙星，荧光物质为7‑氨基‑4‑甲基香豆素‑BSA，简称AMCA‑BSA；(1)银消光探针合成：1)银纳米粒子的合成包括种子生成及逐步生长，a)银种子制备：在100mL体系中调整柠檬酸钠SC浓度至5mM，单宁酸TA0.1mM，加热剧烈搅拌，一开始沸腾，立即加入1mL 25mMAgNO3，溶液马上变成亮黄色，补足体系体积至100mL，得到种子银大小约15nm的种子银溶液；b)银粒子逐步生长：在100mL体系中移除19.5mL反应液，加入16.5mL水，温度设定到90℃，加入0.5mL 25mM SC，1.5mL 2.5mM TA，1mL 25mMAgNO3，补足体系体积至100mL，搅拌30min，重复"移除19.5mL反应液，加入16.5mL水，0.5mL 25mM SC，1.5mL 2.5mM TA和1mL 25mMAgNO3，补足体系体积至100mL，90℃搅拌30min"这一过程9次，获得SPR吸收峰为442nm的银纳米粒子，与AMCA发射光一致；2)银纳米粒子与抗恩诺沙星单克隆抗体结合：取1mL银纳米粒子溶液，7500转离心10min，弃上清；沉淀重悬于1mL含沙恩诺沙星6.5μg的0.1M硼酸溶液，NaOH调pH至7.5；室温搅拌2h，离心10min，弃上清；重悬于含0.1％(w/v)BSA的0.1M pH 7.5含0.1％(w/v)BSA的0.1M硼酸溶液中，5min后，7500转离心10min，沉淀重悬于0.25mLpH 7.5含0.1％(w/v)BSA的0.1M硼酸溶液，4℃保存备用；(2)合成恩诺沙星检测抗原：称取1mg恩诺沙星、1mg NHS和1mg EDC，溶解于0.2mL DMF中，加入10μL三乙胺，室温搅拌4h，逐滴加入2mL含10mg BSA的0.13M碳酸氢钠溶液中，室温缓慢搅拌过夜，转入4℃0.01M，pH 7.4PBS中透析72h；(3)银纳米粒子消光免疫层析试纸条的组装：试纸条包括滤纸、样本垫、结合垫、NC膜和吸水纸五部分组成；其中，样品垫用包含1％BSA，0.4％吐温20和0.03％叠氮钠的50mM pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液浸润，室温下减湿干燥10h；结合垫用包含0.2％吐温20和2％蔗糖的0.01M pH 7.4的PBS缓冲溶液浸润，室温下减湿干燥12h，银消光探针溶液稀释5倍后以4μL/cm的浓度喷涂在结合垫上；将1.75mg/mL检测抗原与60μg/mLAMCA‑BSA混合后喷涂于NC膜的检测线，0.25mg/mL驴抗鼠二抗与60μg/mL AMCA‑BSA混合后喷涂于NC膜的质控线上，设置各线喷涂量均为0.75μL/cm，将喷涂后的NC膜置于37℃的真空干燥箱中干燥6h；商业化的滤纸和吸水纸不经特殊处理，直接使用；滤纸、样本垫与结合垫层叠组装在NC膜一端，吸水纸层叠在NC膜另一端，五部分整体固定在粘性卡纸上；距离检测线4.0mm至6.0mm处喷涂质控线；切割成宽度3.8mm每条，装入试纸条卡盒中，卡盒与常规的胶体金速测卡盒相同，内有试纸条固定卡槽，在试纸条的滤纸位置留有加样孔，在Nc膜上检测线和质控线位置留有检测窗口；试纸条检测卡与干燥剂一起装入避光袋密封保存待用。