[发明专利]一种用于筛选特异性抗体可变区的方法

摘要

本发明公开了一种利用细菌表面展示系统筛选单链抗体的方法。该方法包括如下步骤：A)构建由不同待检测单链抗体编码基因组成的基因编码库；用于扩增抗体VH和VL的引物对均为同种属简并引物对，用于连接VH和VL的接头为同种属CH1；B)获得特异于所述靶标抗原的所述目标单链抗体的基因编码序列；靶标抗原和待检测单链抗体共表达，并用标签蛋白Flag标记抗原，借助荧光标记抗标签蛋白抗体通过流式细胞分选法筛选获得携带有目标单链抗体的重组细菌后，通过提取质粒重转宿主菌的方法拯救目标单链抗体。本发明在传统的细菌展示技术的基础上，做了改进和创新，根据抗体展示载体所必需的元件和基本原理构建了新的抗体细菌展示系统。

主权项

1.一种获得特异于靶标抗原的目标单链抗体的编码基因的方法，包括如下步骤：A)按照包括如下步骤的方法构建由不同待检测单链抗体编码基因组成的基因编码库：(a1)根据已知的抗体框架区序列，设计并合成用于扩增抗体重链可变区的简并引物对1，以及用于扩增抗体轻链可变区的简并引物对2；所述已知的抗体框架区序列为源自于携带所述靶标抗原的微生物的宿主的抗体框架区序列；(a2)采用所述简并引物1和所述简并引物对2从初始样本中分别扩增得到抗体重链可变区集合和抗体轻链可变区集合；所述初始样本中含有由不同种抗所述靶标抗原的抗体组成的抗体库；所述抗体重链可变区集合为由不同重链可变区组成的集合；所述轻链可变区集合为由不同轻链可变区组成的集合；(a3)将所述抗体重链可变区集合中的不同重链可变区和所述抗体轻链可变区集合中的不同轻链可变区通过重链恒定区CH1进行随机连接，获得由不同待检测单链抗体编码基因组成的基因编码库；所述重链恒定区CH1为源自于携带所述靶标抗原的微生物的宿主的重链恒定区CH1的前15个氨基酸；B)按照包括如下步骤的方法获得特异于所述靶标抗原的所述目标单链抗体的基因编码序列：(b1)将所述基因编码库中的各待检测单链抗体编码基因分别与靶标抗原‑标签蛋白融合基因共同构建于同一表达载体，并使所述待检测单链抗体编码基因融合于信号肽1的编码基因的下游，使所述靶标抗原‑标签蛋白融合基因融合于信号肽2的编码基因的下游，获得重组表达载体库；所述重组表达载体库中各载体上均含有所述靶标抗原‑标签蛋白融合基因和任一种所述待检测单链抗体编码基因；所述靶标抗原‑标签蛋白融合基因为由所述靶标抗原的编码基因和所述标签蛋白的编码基因融合而成的融合基因；所述信号肽1为具有如下功能的信号肽：将与其融合的目的蛋白展示于细菌内膜外侧；所述信号肽2为具有如下功能的信号肽：将与其融合的目的蛋白运送到细菌间质腔后自身完全降解，所述目的蛋白游离于所述细菌间质腔内；所述表达载体为pBGD载体；所述pBGD载体的序列如序列表中序列1所示；(b2)将所述重组表达载体库中的各重组表达载体转入宿主细菌，得到重组细菌库；所述重组细菌库中各重组细菌中均含有任一种所述重组表达载体；(b3)培养所述重组细菌库，诱导所述重组表达载体进行表达，由所述待检测单链抗体编码基因编码所得的待检测单链抗体被展示于所述细菌内膜外侧，由所述靶标抗原‑标签蛋白融合基因编码所得的靶标抗原‑标签融合蛋白游离于所述细菌间质腔内；(b4)去除所述重组细菌库中各重组细菌的外膜，得到原生质球库；所述原生质球库中各原生质球上均展示有任一种所述待检测单链抗体，游离于所述原生质球外的所述靶标抗原‑标签融合蛋白能够被所述待检测单链抗体中的特异性单链抗体所捕获，形成抗原抗体复合物；(b5)将所述原生质球库与经荧光标记的抗所述标签蛋白的抗体共同孵育，只有表面形成了所述抗原抗体复合物的原生质球能够被标记上所述荧光，从所述原生质球库中获得表面被标记上了所述荧光的原生质球，记为荧光‑原生质球；所述荧光‑原生质球的表面展示的所述待检测单链抗体即为所述目标单链抗体；(b6)从所述荧光‑原生质球中提取质粒，再次转入所述宿主细菌，进行所述质粒的扩繁培养，从培养后的细菌中提取所述质粒，保种；对所述质粒测序后获得所述目标单链抗体的基因编码序列。