[发明专利]一种带有筛选标记的CRISPR/Cas9载体及其构建方法在审
| 申请号： | 201810644442.8 | 申请日： | 2018-06-21 |
| 公开（公告）号： | CN108841845A | 公开（公告）日： | 2018-11-20 |
| 发明（设计）人： | 欧阳乐军;李莉梅;陈自银;孙同川;陈梓洛;黄佳玲;布良灏;陈凯钊 | 申请（专利权）人： | 广东石油化工学院 |
| 主分类号： | C12N15/65 | 分类号： | C12N15/65;C12N15/82;C12N9/22 |
| 代理公司： | 北京汇捷知识产权代理事务所(普通合伙) 11531 | 代理人： | 李宏伟 |
| 地址： | 525000 广东省茂*** | 国省代码： | 广东;44 |
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| 摘要： | 本发明公开了一种带有筛选标记的CRISPR/Cas9载体及其构建方法，其步骤为：以分别带有荧光标记基因Mcherry的与35S启动子的质粒为模板，分别扩增Mcherry与35S片段，再通过融合PCR将35S与Mcherry扩增成一个35S+Mcherry的大片段，经电泳、切胶回收目的条带35S+Mcherry；组装重组质粒PHCE‑35S+Mcherry，转化大肠杆菌感受态细胞后提取重组质粒，经PCR鉴定为阳性重组质粒后送样测序鉴定。本发明载体构建只需通过三步PCR，简单易行，无需对酶切载体与PCR产物纯化回收，组装效率高。 | ||
| 搜索关键词： | 筛选标记 重组质粒 构建 扩增 大肠杆菌感受态细胞 阳性重组质粒 荧光标记基因 电泳 测序鉴定 酶切载体 载体构建 组装效率 回收 后提取 切胶 送样 条带 质粒 组装 大片 融合 转化 | ||
【主权项】：
1.一种带有筛选标记的CRISPR/Cas9载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）设计35S‑F、35S‑R、Mcherry‑F、Mcherry‑R和测序引物：（2）以分别带有荧光标记基因Mcherry的与35S启动子的质粒为模板，对Mcherry与35S片段进行PCR扩增；（3）PHCE‑Cas9质粒线性化；（4）35S+Mcherry和PHCE‑Cas9质粒重组；（5）重组载体PHCE‑35S+Mcherry转化；（6）PHCE‑35S+Mcherry质粒提取并送样测序，制备得到带有筛选标记的CRISPR/Cas9载体。
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