[发明专利]基于肽传感器的玉米赤霉烯酮电化学发光传感器的制备

摘要

本发明公开一种基于肽传感器的玉米赤霉烯酮无毒电化学发光传感器的制备。该传感器是以聚乙烯吡咯烷酮辅助合成的TiO2介晶（ps‑TiO2 MC）和壳聚糖（CS）为传感平台，利用ps‑TiO2 MC大的比表面积及CS特有的官能团来固定化玉米赤霉烯酮抗体(Ab);以巯基乙胺功能化的镍铁纳米管作为支架，其大的比表面积可以为发光试剂钌联吡啶(Ru(bpy)32+)提供更多的吸附位点，也能够固定大量的具有模拟玉米赤霉烯酮作用的肽。基于以上优点，构造了一种无毒竞争型电致化学发光免疫传感器，实现对玉米赤霉烯酮的高灵敏检测，该传感器具有灵敏度高、稳定性好等优点，在临床应用方面具有较重要的应用价值及实际意义。

主权项

1.一种基于肽传感器的玉米赤霉烯酮的无毒电化学发光竞争型免疫传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)玻碳电极(GCE）首先在铺有氧化铝粉末的麂皮上机械打磨抛光，用二次水洗去表面残留粉末，再移入超声水浴中清洗，直至清洗干净，最后依序用乙醇，稀酸和水彻底洗涤；(2)滴加5 μL 浓度为4 mg/mL 的聚乙烯吡咯烷酮 ( PVP ) 辅助合成的TiO2介晶 ( ps‑TiO2 MC ) 与壳聚糖（CS）混合液于干净的玻碳电极表面，红外灯下烘干，冷却至室温，制得ps‑TiO2 MC/CS修饰玻碳电极；(3)滴加5 μL浓度为5.0 wt.%的戊二醛 ( GA ) 溶液与步骤 ( 2) 所制得的修饰电极表面活化40 min， 用去离子水去除多余的试剂，并在室温下晾干；(4)取5 μL 浓度为50 μg/mL的玉米赤霉烯酮抗体 ( anti‑ZEA ) 溶液于步骤 ( 3 ) 修饰电极表面并在4°C冰箱中孵育 1 h， 用去离子水洗去物理吸附的anti‑ZEA，在室温下晾干，制得anti‑ZEA/ps‑TiO2 MC/CS修饰玻碳电极；(5)取3 μL 浓度为 5.0 wt.% 的BSA 滴加到步骤 ( 4 ) 所制得的修饰电极表面并在4°C冰箱中孵育40 min, 以封闭电极表面上非特异性活性位点，用去离子水冲洗电极表面以洗去物理吸附，并保存在4°C冰箱中；(6)取体积比为 1:1 的20 mmol/L巯基乙胺 ( cysteamine ) 溶液与镍铁纳米管 ( NiFe2O4 NTS ) 溶液在室温下混合震荡6 h, 洗涤、离心制得 cysteamine@ NiFe2O4 NTs复合物溶液并将其重新分散在去离子水中；然后将体积比为 1:1 的 0.05 wt.% 的Nafion与 1.0×10‑3 mol/L 钌联吡啶（Ru(bpy)32+）的混合液加入到上述制得的复合物溶液中，混合震荡 5 h, 经离心、洗涤、再分散制得 Nafion‑Ru(bpy)32+/cysteamine@ NiFe2O4 NTs复合物；GA作为肽与制得的Nafion‑Ru(bpy)32+/cysteamine@ NiFe2O4 NTs复合物之间的连接剂，先将200 μL 5.0 wt.% GA加入到Nafion‑Ru(bpy)32+/cysteamine@ NiFe2O4 NTs 混合溶液中，混合震荡 2 h, 洗涤、离心，去除多余的GA试剂，再向该溶液中加入100 μL 50 μg/mL肽，轻微摇动5 h, 经离心、洗涤、再分散得到peptide/Nafion‑Ru(bpy)32+/cysteamin复合物混合液；最后在上述溶液中加入 50 μL 5.0 wt.% 的BSA封闭非特异性吸附位点, 再用去离子水洗涤反应混合物数次，经离心后重新分散于去离子水中制得电化学发光探针( peptide/Nafion‑Ru(bpy)32+/ cysteamine@ NiFe2O4 NTs)复合物溶液，储存在4°C冰箱中备用；(7)取不同浓度的玉米赤霉烯酮 ( ZEA ) 标准溶液加入到步骤 ( 6 ) 所制得的电化学发光探针( peptide/Nafion‑Ru(bpy)32+/ cysteamine@ NiFe2O4 NTs)溶液中得到新的孵化液，然后将该孵化液滴加到步骤 ( 5 ) 获得的修饰电极上，在4°C冰箱中孵育60 min，用去离子水冲洗电极表面，制得ZEA/peptide/Nafion‑Ru(bpy)32+/cysteamin/ps‑TiO2 MC/CS修饰玻碳电极，并保存在4 °C冰箱中备用。