[发明专利]一株产脂肪酶工程菌、其构建方法和应用

摘要

本发明公开了一株产脂肪酶工程菌PG1/pRK2‑km‑P_apra‑lipAB，采用Red/ET直接克隆技术将B.glumae PG1基因组中的脂肪酶操纵子lipAB直接克隆至载体p15A‑cm上，通过亚克隆技术替换克隆载体上的复制子和选择性标记基因，并将lipA基因的ATG前面200bp的序列替换为apra+rbs(921bp)，使脂肪酶操纵子lipAB位于P_apra的调控下，最终获得脂肪酶表达载体pRK2‑km‑P_apra‑lipAB；将脂肪酶表达载体转化入B.glumae PG1中得到。其对脂肪酶底物三丁酸甘油酯和对硝基苯酚棕榈酸酯显示出较高的水解能力。

主权项

1.一株产脂肪酶工程菌PG1/pRK2‑km‑P_apra‑lipAB，是以菌种编号为CBS 322.89的B.glumae PG1为宿主菌，通过以下构建方法得到的：1)利用Red/ET同源重组技术对B.glumae PG1基因组上的脂肪酶操纵子lipAB进行直接克隆，构建克隆载体p15A‑cm‑lipAB；该步中所用到的引物的核苷酸序列为：PG1‑lipase‑A：tcgacatgacacggcgcgagacgtattgcggcgcagcgcgAAGGCCGCGCTGTCGGTGAACGCTCTCTACTA，如SEQ ID NO.1所示；PG1‑lipase‑S：gtatccgcaggtggccgatatcgtctggcggatggcgctgTGCGGGGCGGTGAGACGTTGATCGGCACGTA，如SEQ ID NO.2所示；2)利用Red/ET同源重组技术对lipAB操纵子进行亚克隆，构建工程菌株GB05‑dir/pRK2‑km‑lipAB；该步中所用到的引物的核苷酸序列为：RK2‑km‑A：atgctgcggcgcgcaagcgggcgcgatcgatccggtgaatCACTGAGCGTCTAGCGTTTG，如SEQ ID NO.3所示；RK2‑km‑S：gccgcgagcgagcaagaatcacgacgctctgcaacaatgcGCTCGCCAGTCGATTGGCTGA，如SEQ ID NO.4所示；3)利用Red/ET同源重组技术将脂肪酶操纵子lipAB的启动子P_lipAB替换为P_apra，该步中所用到的引物的核苷酸序列为：P_apra‑A：ccgccctcgccgccaccctggaacgcatcgatctgaccatAATCTGTACCTCCTTAAGTCAG，如SEQ ID NO.5所示；P_apra‑S：gatcgcgcccgcttgcgcgccgcagcatccgcgccgtcatACGCTCAGTGGAACGAGGTT；如SEQ ID NO.6所示；构建并筛选出重组载体GB05 dir/pRK2‑km‑P_apra–lipAB，该步中所用到的引物的核苷酸序列为：P_apra‑F：AGTGATTCACCGGATCGATC，如SEQ ID NO.7所示；P_apra‑R：TGGAACGCATC GATCTGACC，如SEQ ID NO.8所示；4)利用电穿孔法将来源于大肠杆菌GB05‑dir中的质粒pRK2‑km‑P_apra‑lipAB转化至B.glumae PG1中，筛选出PG1/pRK2‑km‑P_apra‑lipAB工程菌。