[发明专利]一种抗赤点石斑鱼神经坏死病毒青鳉单倍体胚胎干细胞的制备方法及应用

摘要

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种抗赤点石斑鱼神经坏死病毒青鳉单倍体胚胎干细胞的制备方法及其应用。通过乙烷基亚硝基脲(ENU)诱变青鳉单倍体胚胎干细胞(HX1细胞)，进而筛选得到抗赤点石斑鱼神经坏死病毒青鳉单倍体胚胎干细胞G1。所述抗赤点石斑鱼神经坏死病毒青鳉单倍体胚胎干细胞G1于2018年1月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：C201832。为进一步鉴定参与病毒感染的宿主因子提供了实验和理论基础，并为抗病毒鱼的遗传育种提供了新途径。

主权项

1.一种抗赤点石斑鱼神经坏死病毒青鳉单倍体胚胎干细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)青鳉单倍体胚胎干细胞传代培养：将青鳉单倍体胚胎干细胞在ESM4培养基中培养，加入蛋白补充剂，细胞用胰蛋白酶消化后传至铺有明胶的6孔细胞培养板，放置于28℃培养箱中培养24h；(2)乙烷基亚硝基脲诱变：在培养基中加入浓度为10μM的O6‑BG预处理24h，然后去掉培养基，更换为乙烷基亚硝基脲终浓度为10mg/ml的ESM4培养基，继续培养48h，将诱变后的青鳉单倍体胚胎干细胞接种于24孔细胞培养板，每孔3×104细胞，置于28℃培养箱培养24h；(3)赤点石斑鱼神经坏死病毒感染：去掉培养基，加入含有赤点石斑鱼神经坏死病毒的ESM4培养基，将存活的乙烷基亚硝基脲诱变的青鳉单倍体胚胎干细胞继续传代，细胞经连续传代稳定生长后，经胰蛋白酶消化后重悬于ESM4培养基，取重悬液接种于直径为10cm的培养皿中，放置于28℃培养箱继续培养，每隔3天更换一半的培养基；(4)制备抗赤点石斑鱼神经坏死病毒青鳉单倍体胚胎干细胞：待克隆样细胞生长至直径为200μm时，在体式显微镜下挑取克隆样细胞，并接种于提前铺有明胶的96孔细胞培养板中，待96孔细胞培养板中细胞长至密度为90％‑100％时，继续先后传代至48孔细胞培养板，12孔细胞培养板和6孔细胞培养板，最终传至10cm培养皿，成功获得50个单克隆青鳉单倍体胚胎干细胞系，选择生长状态良好的G1细胞系。