[发明专利]一种猪单胚胎体外培养方法

摘要

本发明公开了一种猪单胚胎体外培养方法。属于农业‑畜牧兽医领域。具体为采用饲养层细胞微滴与单个胚胎进行共培养，获得了较好的发育结果，单胚胎培养与传统所用的多胚胎培养发育进程是一致的，而且，带透明带附着或去透明带的单胚胎7天均可获得猪孤雌发育囊胚。本发明中提供的饲养层细胞微滴制备简单，按照本发明中提供的方法能够为研究单个胚胎的发育提供可靠的原始材料，完全可以满足对猪单个胚胎发育进程跟踪观察及进一步研究的需要。本发明中提供的单胚胎培养方法可广泛应用于多种物种的单胚胎培养中。

主权项

1.一种猪单胚胎体外培养方法，其特征在于，包括如下步骤：1）猪体外成熟卵母细胞制备：采集母猪卵巢；卵巢组织先用75%的酒精洗涤1 min，然后用灭菌且预热的生理盐水清洗3次之后用装有标准20号针头的无菌注射器，无菌注射器内有少量平衡后的DPBS，抽取卵巢表面直径为3‑8 mm的卵泡，抽取液注入50 mL尖底离心管中，置于39 ℃水浴锅中的尖底离心管中；待卵丘‑卵母细胞复合体（COCS)沉淀后，用DPBS洗涤2次后在体视显微镜下检卵；捡取形态正常、胞质均一且至少有3层颗粒细胞包裹的COCs，将检出的COCs用含5%胎牛血清的DPBS洗涤3次，然后用体外成熟培养液洗涤3次，移入含有500μL体外成熟培养液并覆盖有石蜡油的五孔细胞培养板中；每滴放COCs100‑150枚；液体预先在CO2 培养箱中平衡2 h以上；体外成熟培养42‑44 h，培养条件39 ℃，5% CO2，饱和湿度；体外成熟培养液为：TCM‑199+0.1%聚乙烯醇+3.05 mM葡萄糖+0.91mM丙酮酸钠+0.57 mM L‑半胱氨酸+100 IU /mL青霉素+100 μg/mL链霉素+10%（V/V）卵泡液+10 IU/mL PMSG+10 IU/mL hCG；2）猪体外成熟卵母细胞孤雌激活：将体外成熟培养42‑44h的COCs移入含0.1%透明质酸酶的DPBS中消化并用移液枪反复轻微吹打以除去卵丘细胞，用提前预热的激活液洗涤3次，置入带有激活液的融合槽中，用BTX‑2001融合仪进行电激活，激活参数：30 μs，1.1kv/cm，1次直流电脉冲；激活后的卵母细胞用提前预热的胚胎培养液NCSU‑23洗涤三次后备用；激活液配方：0.25mol/L甘露醇+0.5mol/L氯化钙+0.5mol/L硫酸镁+0.5mol/L HEPES+0.01%（V/V）PVA；3）共培养饲养层细胞微滴制备：（1）输卵管上皮细胞饲养层微滴制备A、输卵管上皮细胞的分离与原代培养：屠宰场获得母猪输卵管后放入添加双抗的30‑37℃灭菌生理盐水中于2h内带回实验室，用灭菌剪刀剪去多余的输卵管系膜，并将输卵管剪成长度2cm的小段，用35℃添加双抗的无菌生理盐水洗涤3次，置于直径35mm的一次性塑料小皿中，在体视显微镜下一边观察一边冲取上皮细胞，操作时左手拿钟表镊子夹住输卵管一侧断口处，右手用1毫升的一次性注射器吸取工作浓度0.25%胰酶直接从镊子夹住的输卵管断口处缓慢注入，以冲取输卵管上皮细胞，重复2‑3次后收集小皿中含有输卵管上皮细胞的胰酶液体，迅速加入等体积的含有10%FBS的DMEM以终止消化，避免消化过度，细胞死亡，胰酶在输卵管中的时间控制在5min以内，以保证输卵管上皮细胞的纯度；将收集的液体3000r/min离心5min，丢弃上清，加入含有10%FBS的DMEM重复离心2次弃上清，得到的沉淀置入含有2毫升添加10%FBS DMEM 的6孔板中进行培养；培养3天后更换新鲜培养基，待细胞长满6孔板板底时可以消化备用；B、饲养层共培养细胞微滴制备：于共培养前48h用0.25%胰酶消化已经长满6孔板的输卵管上皮细胞，时间2min，加入含有10%FBS的DMEM终止消化，用量程为1毫升移液器轻轻吹打成单细胞悬液，细胞密度调整为104个/ml并保证细胞悬液中细胞是均匀存在的，利用此细胞悬液制备共培养饲养层单胚胎培养微滴即用量程为10μL的移液器吸取10μL细胞悬液，在35mm的一次性小皿上做细胞微滴；每个微滴大小10μL覆盖石蜡油，置于39℃，5% CO2，饱和湿度的培养箱中培养，48h后用于细胞共培养；或者，（2）卵丘颗粒细胞饲养层微滴制备：将培养成熟的卵母细胞置于成熟液中，用移液枪反复吹打除去卵母细胞外的卵丘细胞，吹打干净并捡出卵母细胞，余下的卵丘颗粒细胞即留在液体中，调整细胞密度为104个/ml并保证细胞悬液中细胞是均匀存在的，利用此细胞悬液制备共培养饲养层单胚胎培养微滴即用量程为10μL的移液器吸取10μL细胞悬液，在35mm的一次性小皿上做细胞微滴；每个微滴大小10μL覆盖石蜡油，置于39℃，5% CO2，饱和湿度的培养箱中培养，48h后用于细胞共培养；或者，（3）猪胎儿成纤维细胞饲养层微滴制备A、猪胎儿成纤维细胞制备：具体操作方法参照ZL201310381274.5《湖北白猪成纤维细胞系》中所公开的方法制备；B、饲养层共培养细胞微滴制备：于共培养前48h用0.25%胰酶消化已经长满6孔板的猪胎儿成纤维细胞，时间2min，加入含有10%FBS的DMEM终止消化，用量程为1毫升移液器轻轻吹打成单细胞悬液，细胞密度调整为104个/ml并保证细胞悬液中细胞是均匀存在的，利用此细胞悬液制备共培养饲养层单胚胎培养微滴即用量程为10μL的移液器吸取10μL细胞悬液，在35mm的一次性小皿上做细胞微滴；每个微滴大小10μL覆盖石蜡油，置于39℃，5% CO2，饱和湿度的培养箱中培养，48h后用于细胞共培养；4）单胚胎与饲养层细胞共培养：（1）带透明带附着的卵母细胞与饲养层细胞共培养于卵母细胞置入微滴前2h将微滴中的细胞培养基DMEM换成新鲜的胚胎培养基NCSU‑23置培养箱中备用；选取步骤2）获得的带有第一极体、胞质均匀的体外成熟卵母细胞于提前平衡2h的胚胎培养基NCSU‑23中，洗涤3遍后置入步骤3）制备的共培养饲养层单细胞微滴中进行共培养，每个微滴置1枚卵母细胞；48h进行半量换液；或者，（2）去透明带的卵母细胞与饲养层细胞共培养于卵母细胞置入微滴前2h将微滴中的细胞培养基DMEM换成新鲜的胚胎培养基NCSU‑23置培养箱中备用；体外成熟卵母细胞孤雌激活后，选取带有第一极体、胞质均匀、胞膜完整的体外成熟卵母细胞用工作浓度0.25%的链霉蛋白酶消化去除透明带，将无透明带卵母细胞于提前平衡2h的胚胎培养基NCSU‑23中洗涤3遍后置入步骤3）制备的共培养饲养层单胚胎培养微滴中进行共培养，每个微滴置1枚卵母细胞，48h进行半量换液；5）7天获得猪孤雌发育囊胚：于36h统计胚胎卵裂率，共培养7d后，在显微镜下观察胚胎发育情况，并统计囊胚发育率。