[发明专利]利用免疫组化法检测菠萝胚珠减数分裂蛋白分布的方法

摘要

本发明提供一种利用免疫组化法检测菠萝胚珠减数分裂蛋白分布的方法，利用拟南芥的减数分裂时期特异表达基因DMC1的抗体，经过精心调整溶液浓度，处理时间，及材料处理方式，利用激光共聚焦显微镜可以在胚珠中检测到DMC1抗体的荧光，以此来观察察菠萝胚珠减数分裂过程重要基因DMC1在染色体上的表达情况。

主权项

1.一种利用免疫组化法检测菠萝胚珠减数分裂蛋白分布的方法，其特征在于：所述方法包括如下：（1）溶液的配制：PBS溶液配制：采用去离子水、KH2PO4和Na2HPO4·2H2O配制PBS溶液，按以下步骤进行：(1) 配制1/15mol/L KH2PO4，即每升水中溶解9.078克KH2PO4；(2) 配制1/15mol/LNa2HPO4·2H2O，即每升水中溶解11.876克Na2HPO4·2H2O；(3) 将体积分数18.2%KH2PO4溶液和81.8%Na2HPO4·2H2O混合；固定液：含4wt.%多聚甲醛的PBS溶液；包埋液：30wt.% 聚丙烯酰胺200μl，25wt.%过硫酸铵2μl ，水197μl，TEMD 1μl，酶解液：含1wt.% driselase、0.5wt.% cellulose、1wt.% pectolyase、1% BSA的PBS溶液；（2）材料的获得取正在进行减数分裂的胚珠；（3）材料固定剥出花苞，用镊子小心挑出，置于固定液中固定3‑5小时；（4）包埋胚珠1×PBS溶液洗3遍，在载玻片上加1×PBS，再将胚珠置于其中，然后在解剖镜下将包在胚珠外的组织去掉，换成包埋液，盖上盖玻片，轻轻压散胚珠；室温静置20分钟后，小心揭去盖玻片；（5）酶解加50μl酶解液，盖上封口膜，37℃湿盒中反应1小时；（6）加一抗揭膜后，用含0.2wt.%Triton‑100的1×PBS溶液洗3次，每次15分钟，按1:500的体积比，用1×PBS溶液稀释一抗，加50μl一抗稀释液，盖上封口膜，4℃，8小时或者过夜孵育；（7）加二抗揭膜后，含0.2wt.%Triton‑100的PBS溶液洗3次，每次15分钟，按1:1000的体积比，用1×PBS稀释二抗，加50μl二抗稀释液，盖上封口膜，4℃，8小时或者过夜孵育；（8）制片后，Confocal显微镜拍照揭膜后，含0.2wt.%Triton‑100的PBS溶液洗3次，每次15分钟，加PI染液，盖上封口膜，室温孵育20分钟， PBS溶液洗2次，每次15分钟；加防淬灭剂，盖上盖玻片，Confocal显微镜下观察。