[发明专利]一种提高棉花抗黄萎病相关蛋白CkSYP71及其编码的基因和应用

摘要

本发明公开了一种提高棉花抗黄萎病相关蛋白CkSYP71及其编码的基因和应用。本发明提供的蛋白基因CkSYP71全长序列如SEQ ID NO.1所示及其编码氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列组成的蛋白质；本发明蛋白CkSYP71来自荒漠植物‑牛心朴子草，为植物中特有的Qc‑SNARE蛋白，转录水平分析表明CkSYP71基因同时受黄萎病菌和H2O2的诱导。转基因CkSYP71实验证明过表达CkSYP71基因的棉花植株对黄萎病抗性明显提高，从而在植物抗病过程中发挥重要的作用。

主权项

1.牛心朴子草基因CkSYP71，其特征在于，CkSYP71基因全长序列如SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述的牛心朴子草基因CkSYP71编码的植物中特有Qc‑SNARE蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.含有权利要求1所述的牛心朴子草基因CkSYP71的植物表达载体。

4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述的表达载体是将所述的牛心朴子草基因CkSYP71插入植物表达载体pCAMBIA1300的XbaI和SalI酶切位点所得。

5.权利要求1所述的牛心朴子草基因CkSYP71的基因工程应用。

6.权利要求1所述的牛心朴子草基因CkSYP71通过基因工程方法培育棉花抗黄萎病品种的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：

1)提取牛心朴子草总RNA；

2)克隆牛心朴子草基因CkSYP71；

通过菌落原位杂交获得CkSYP71部分序列；将步骤1)获得总RNA反转录成cDNA第一链，以此链为模板，以P1：SEQ ID NO.3和P2：SEQ ID NO.4为引物进行RACE‑PCR,扩增3`端序列。序列拼接获得CkSYP71的全长序列SEQ ID NO.1；

3)植物表达载体的构建

根据CkSYP71的全长序列SEQ ID NO.1,设计能够扩增完整编码区的引物，引物序列分别为:P7：SEQ ID NO.9和P8：SEQ ID NO.10；以步骤2)获得cDNA为模板，采用高保真酶进行PCR扩增，回收PCR产物，将其连接到pCAMBIA1300植物表达载体上，测序鉴定表达载体中编码区阅读框正确；

4)转基因棉花植株的获得

将步骤3)获得表达载体pCAMBIA1300‑pSUPER::CkSYP71转入农杆菌GV3101，然后转入棉花植株，对获得转基因棉株进行Real‑time PCR定量验证后，进行棉株的黄萎病发病情况调查，进行转基因CkSYP71棉株筛选，获得抗黄萎病的棉花品种。