[发明专利]一种人类多能干细胞向造血干细胞分化的方法及培养添加剂

摘要

本发明公开了一种人类多能干细胞向造血干细胞分化的方法及培养添加剂。本发明研制了一种能够大幅增强人类多能干细胞向造血干细胞分化效率的培养液。本发明还提供了一种人类多能干细胞向造血干细胞分化的新方法。采用本发明提供的制备方法可以获得造血干细胞，与传统的基质细胞共培养法及拟胚体培养法相比，该方法可以高效获得表达CD34和CD43双阳性的造血干细胞，化学成分确定、无动物源成分，大大提高了制备细胞的安全性，且具有耗时短、分化效率高、成本较低等特点。采用本发明提供的制备方法可大规模生产人造血干细胞，质量稳定，安全性高，为组织工程、药物研发和细胞治疗提供大量细胞来源。

主权项

1.用于制备造血干细胞的试剂盒，包括培养液II、培养液III、培养液IV和培养液V：所述培养液II为如下(a1)‑(a6)中的任一种：(a1)含有无胰岛素的B27添加剂和人骨形成蛋白4的培养液；(a2)含有无胰岛素的B27添加剂和人骨形成蛋白4的培养液；所述无胰岛素的B27添加剂在培养液II中的体积百分含量为1‑2％；所述人骨形成蛋白4在培养液II中的浓度为5‑10ng/ml；(a3)含有无胰岛素的B27添加剂和人骨形成蛋白4的培养液；所述无胰岛素的B27添加剂在培养液II中的体积百分含量为2％；所述人骨形成蛋白4在培养液II中的浓度为5ng/ml；(a4)含有无胰岛素的B27添加剂、L‑谷氨酰胺或其替代物、甘氨酸、L‑丙氨酸、L‑门冬氨酸、L‑天冬氨酸、L‑谷氨酸、L‑脯氨酸、L‑丝氨酸、青霉素、链霉素、维生素C和人骨形成蛋白4的培养液；(a5)含有无胰岛素的B27添加剂、L‑谷氨酰胺或其替代物、甘氨酸、L‑丙氨酸、L‑门冬氨酸、L‑天冬氨酸、L‑谷氨酸、L‑脯氨酸、L‑丝氨酸、青霉素、链霉素、维生素C和人骨形成蛋白4的培养液；所述无胰岛素的B27添加剂在培养液II中的体积百分含量为1‑2％；所述L‑谷氨酰胺或其替代物在培养液II中的浓度为0.5‑1mM；所述甘氨酸在培养液II中的浓度为750.0ng/ml；所述L‑丙氨酸在培养液II中的浓度为890ng/mL；所述L‑门冬氨酸在培养液II中的浓度为1320ng/mL；所述L‑天冬氨酸在培养液II中的浓度为1330ng/mL；所述L‑谷氨酸在培养液II中的浓度为1470ng/mL；所述L‑脯氨酸在培养液II中的浓度为1150ng/mL；所述L‑丝氨酸在培养液II中的浓度为1050ng/mL；所述青霉素在培养液II中的浓度为50‑100U/ml；所述链霉素在培养液II中的浓度为50‑100μg/ml；所述维生素C在培养液II中的浓度为25‑50ng/ml；所述人骨形成蛋白4在培养液II中的浓度为5‑10ng/ml；(a6)含有无胰岛素的B27添加剂、L‑谷氨酰胺或其替代物、甘氨酸、L‑丙氨酸、L‑门冬氨酸、L‑天冬氨酸、L‑谷氨酸、L‑脯氨酸、L‑丝氨酸、青霉素、链霉素、维生素C和人骨形成蛋白4的培养液；所述无胰岛素的B27添加剂在培养液II中的体积百分含量为2％；所述L‑谷氨酰胺或其替代物在培养液II中的浓度为1mM；所述甘氨酸在培养液II中的浓度为750.0ng/ml；所述L‑丙氨酸在培养液II中的浓度为890ng/mL；所述L‑门冬氨酸在培养液II中的浓度为1320ng/mL；所述L‑天冬氨酸在培养液II中的浓度为1330ng/mL；所述L‑谷氨酸在培养液II中的浓度为1470ng/mL；所述L‑脯氨酸在培养液II中的浓度为1150ng/mL；所述L‑丝氨酸在培养液II中的浓度为1050ng/mL；所述青霉素在培养液II中的浓度为100U/ml；所述链霉素在培养液II中的浓度为100μg/ml；所述维生素C在培养液II中的浓度为50ng/ml；所述人骨形成蛋白4在培养液II中的浓度为5ng/ml；所述培养液III为如下(b1)‑(b3)中的任一种：(b1)含有GSK3抑制剂的培养液II；(b2)含有1‑2μMGSK3抑制剂的培养液II；(b3)含有2μMGSK3抑制剂的培养液II；所述培养液IV为如下(c1)‑(c6)中的任一种：(c1)含有添加了胰岛素的B27添加剂、人血管内皮生成因子VEGF‑165和人成纤维生长因子的培养液；(c2)含有添加了胰岛素的B27添加剂、人血管内皮生成因子VEGF‑165和人成纤维生长因子的培养液；所述添加了胰岛素的B27添加剂在培养液IV中的体积百分含量为1‑2％；所述人血管内皮生成因子VEGF‑165在培养液IV中的浓度为25‑50ng/ml；所述人成纤维生长因子在培养液IV中的浓度为5‑10ng/ml；(c3)含有添加了胰岛素的B27添加剂、人血管内皮生成因子VEGF‑165和人成纤维生长因子的培养液；所述添加了胰岛素的B27添加剂在培养液IV中的体积百分含量为2％；所述人血管内皮生成因子VEGF‑165在培养液IV中的浓度为50ng/ml；所述人成纤维生长因子在培养液IV中的浓度为10ng/ml；(c4)含有添加了胰岛素的B27添加剂、L‑谷氨酰胺或其替代物、甘氨酸、L‑丙氨酸、L‑门冬氨酸、L‑天冬氨酸、L‑谷氨酸、L‑脯氨酸、L‑丝氨酸、青霉素、链霉素、维生素C、人血管内皮生成因子VEGF‑165和人成纤维生长因子的培养液；(c5)含有添加了胰岛素的B27添加剂、L‑谷氨酰胺或其替代物、甘氨酸、L‑丙氨酸、L‑门冬氨酸、L‑天冬氨酸、L‑谷氨酸、L‑脯氨酸、L‑丝氨酸、青霉素、链霉素、维生素C、人血管内皮生成因子VEGF‑165和人成纤维生长因子的培养液；所述添加了胰岛素的B27添加剂在培养液IV中的体积百分含量为1‑2％；所述L‑谷氨酰胺或其替代物在培养液IV中的浓度为0.5‑1mM；所述甘氨酸在培养液IV中的浓度为750.0ng/ml；所述L‑丙氨酸在培养液IV中的浓度为890ng/mL；所述L‑门冬氨酸在培养液IV中的浓度为1320ng/mL；所述L‑天冬氨酸在培养液IV中的浓度为1330ng/mL；所述L‑谷氨酸在培养液IV中的浓度为1470ng/mL；所述L‑脯氨酸在培养液IV中的浓度为1150ng/mL；所述L‑丝氨酸在培养液IV中的浓度为1050ng/mL；所述青霉素在培养液II中的浓度为50‑100U/ml；所述链霉素在培养液II中的浓度为50‑100μg/ml；所述维生素C在培养液IV中的浓度为25‑50ng/ml；所述人血管内皮生成因子VEGF‑165在培养液IV中的浓度为25‑50ng/ml；所述人成纤维生长因子在培养液IV中的浓度为5‑10ng/ml；(c6)含有添加了胰岛素的B27添加剂、L‑谷氨酰胺或其替代物、甘氨酸、L‑丙氨酸、L‑门冬氨酸、L‑天冬氨酸、L‑谷氨酸、L‑脯氨酸、L‑丝氨酸、青霉素、链霉素、维生素C、人血管内皮生成因子VEGF‑165和人成纤维生长因子的培养液；所述添加了胰岛素的B27添加剂在培养液IV中的体积百分含量为2％；所述L‑谷氨酰胺或其替代物在培养液IV中的浓度为1mM；所述甘氨酸在培养液IV中的浓度为750.0ng/ml；所述L‑丙氨酸在培养液IV中的浓度为890ng/mL；所述L‑门冬氨酸在培养液IV中的浓度为1320ng/mL；所述L‑天冬氨酸在培养液IV中的浓度为1330ng/mL；所述L‑谷氨酸在培养液IV中的浓度为1470ng/mL；所述L‑脯氨酸在培养液IV中的浓度为1150ng/mL；所述L‑丝氨酸在培养液IV中的浓度为1050ng/mL；所述青霉素在培养液II中的浓度为50‑100U/ml；所述链霉素在培养液II中的浓度为50‑100μg/ml；所述维生素C在培养液IV中的浓度为50ng/ml；所述人血管内皮生成因子VEGF‑165在培养液IV中的浓度为50ng/ml；所述人成纤维生长因子在培养液IV中的浓度为10ng/ml；所述培养液V为如下(d1)‑(d3)中的任一种：(d1)含有TGFβ抑制剂的培养液IV；(d2)含有5‑10μM TGFβ抑制剂的培养液IV；(d3)含有10μM TGFβ抑制剂的培养液IV。